程保平, 彭埃天, 宋曉兵, 凌金鋒, 陳 霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所;廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510640)

實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

三種PCR方法檢測(cè)柑橘黃龍病菌的效果比較

程保平, 彭埃天*, 宋曉兵, 凌金鋒, 陳 霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所;廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510640)

為了比較常規(guī)PCR、巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在大田檢測(cè)中對(duì)柑橘黃龍病(Huanglongbing, HLB)的檢測(cè)效果,首先比較了3種檢測(cè)方法對(duì)柑橘黃龍病菌檢測(cè)的靈敏度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3種檢測(cè)方法的靈敏度依次為常規(guī)PCR<巢式PCR<實(shí)時(shí)熒光定量PCR。運(yùn)用3種檢測(cè)方法對(duì)廣東5個(gè)柑橘品種上的189個(gè)黃龍病疑似病樣進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黃龍病檢出率依次為常規(guī)PCR<巢式PCR<實(shí)時(shí)熒光定量PCR。研究表明：常規(guī)PCR適合以較低成本大規(guī)模檢測(cè)黃龍?。粚?shí)時(shí)熒光定量PCR具有最大的檢測(cè)靈敏度；巢式PCR檢測(cè)技術(shù)同時(shí)具有前兩者的一些優(yōu)點(diǎn),但操作較復(fù)雜,適合技術(shù)熟練的研究者使用。

柑橘黃龍病; 常規(guī)PCR; 巢式PCR; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; 比較研究

柑橘黃龍病是世界柑橘生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的病害,在我國(guó)及東南亞、非洲、阿拉伯半島、印度、巴西和美國(guó)佛羅里達(dá)和加利福尼亞等國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)生,嚴(yán)重制約著世界柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。

柑橘黃龍病的病原被認(rèn)為是韌皮部桿菌屬,有亞洲種、非洲種和美洲種3個(gè)種[2-3]。目前在我國(guó)傳播的是亞洲種[4]。該病菌主要由接穗、苗木和木虱傳播,還可通過(guò)菟絲子在柑橘間傳播。植株感病后,傳病速度快,目前尚無(wú)有效藥劑和抗病品種,因此及時(shí)準(zhǔn)確地診斷有助于及早清除傳染源,對(duì)于防止病害的快速傳播具有重要意義[5]。

柑橘黃龍病有一些典型的癥狀。初期癥狀：葉脈腫突,枝梢變黃,中質(zhì)硬化、無(wú)光澤。中后期癥狀：病葉陸續(xù)脫落,病梢萌發(fā)早、短而纖弱,病葉細(xì)狹長(zhǎng)、硬化、出現(xiàn)均勻黃化或斑駁癥狀,果實(shí)出現(xiàn)“紅鼻子果”癥狀。最后植株根部腐爛,生長(zhǎng)逐漸衰弱,以致整株死亡[6-7]。但該病的癥狀與缺素、病毒病等有相似的癥狀,而且癥狀診斷帶有很多主觀因素,因此診斷準(zhǔn)確率不高[8]。

20 世紀(jì)90 年代后,隨著分子生物學(xué)方法的發(fā)展,大量準(zhǔn)確靈敏的分子檢測(cè)方法已用于該病的檢測(cè)[9]。目前最廣泛用于黃龍病菌檢測(cè)的是PCR方法[10]。1996年Jagoueix等依據(jù)黃龍病菌核糖體蛋白基因設(shè)計(jì)了特異引物,應(yīng)用常規(guī)PCR 檢測(cè)柑橘黃龍病菌[11]。2007 年Zhou 等為提高檢測(cè)靈敏度,運(yùn)用巢式PCR檢測(cè)黃龍病菌[12]。同樣基于該菌的核糖體蛋白基因,2006 年Wang 等建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法來(lái)檢測(cè)黃龍病菌[13]。本研究綜合比較了這3種檢測(cè)方法對(duì)廣東柑橘黃龍病菌的檢測(cè)靈敏度與田間檢測(cè)率。

1 材料與方法

1.1 樣品與材料

3種PCR檢測(cè)所用的黃龍病疑似樣品分別采自廣東省的龍門(mén)、肇慶、云浮等地的柑橘基地,共189個(gè)樣品。陰性對(duì)照樣品為本研究室種植于防蟲(chóng)網(wǎng)內(nèi)的健康柑橘葉片,陽(yáng)性對(duì)照為種植于防蟲(chóng)網(wǎng)內(nèi)的感染黃龍病柑橘植株的葉片。用于特異性檢測(cè)的病原菌為本研究室保存于PDF培養(yǎng)基上的柑橘潰瘍病菌、柑橘炭疽病菌、辣椒疫霉菌(可危害柑橘)、保存于防蟲(chóng)網(wǎng)室內(nèi)柑橘上的柑橘衰退病病毒和柑橘碎葉病病毒。用于靈敏度測(cè)試的重組質(zhì)粒為插入柑橘黃龍病菌16S rDNA的pMD19重組質(zhì)粒，由本研究室構(gòu)建。

1.2 檢測(cè)葉片樣品處理

田間采集葉片置于塑封袋,再保存于冰盒內(nèi)。制樣時(shí)清洗并晾干柑橘葉片,然后剪取葉片中脈放入滅菌研缽,加入液氮研磨成粉狀,最后按愛(ài)思進(jìn)公司試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品總基因組。質(zhì)粒提取方法同樣參照愛(ài)思進(jìn)公司的試劑盒說(shuō)明書(shū)。在3種檢測(cè)方法的靈敏度試驗(yàn)中,將重組質(zhì)粒DNA原液10倍梯度稀釋為10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5等系列稀釋液,然后作為PCR的模板。以本研究室保存于防蟲(chóng)網(wǎng)室內(nèi)的健株柑橘葉脈DNA為陰性對(duì)照,以保存于防蟲(chóng)網(wǎng)內(nèi)的感染黃龍病的柑橘葉片為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 PCR 引物

常規(guī)PCR：上游引物OI1：5′-GCGCGTATGC-AATACGAGCGGCA-3′,下游引物OI2c：5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′[11]。巢式PCR 引物對(duì)：外側(cè)引物為OI1/OI2c; 內(nèi)側(cè)引物的上游引物CGO3F：5′-RGGGAAAGATTTTATTGGAG-3′,下游引物對(duì)CGO5R: 5′-GAAAATAYCATCT-CTGATATCGT-3′[12]。SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)上游引物CQULA04F: 5′-TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3′,下游引物CQULA04R：5′-CCAACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA-3′[13],引物對(duì)均由廣州英駿公司合成。PCR 緩沖液、Taq酶、SYBR Premix ExTaq等購(gòu)自大連寶生物公司。質(zhì)粒DNA提取試劑盒和基因組DNA提取試劑盒等購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)公司。使用儀器為：iCyclerTMABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR,Molecular Imager Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)。

1.4 PCR檢測(cè)體系及擴(kuò)增程序

50 μL 反應(yīng)體系,包括 PremixTaq25 μL、10 μmol/L 的引物各2 μL,DNA 模板1 μL,補(bǔ)水至50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min[11]。

1.5 巢式PCR 檢測(cè)

采用常規(guī)PCR中的OI1/OI2c為巢式PCR外側(cè)引物進(jìn)行第1輪的PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系以及反應(yīng)程序參照常規(guī)PCR反應(yīng)。取1 μL第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板,以CGO3F/CGO5R為內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系與常規(guī)PCR相同。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳[12]。

1.6 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

20 μL 的反應(yīng)體系,包括SYBR Premix ExTaq緩沖液10 μL、10 μmol /L 引物對(duì)各0.8 μL、模板1 μL、ROX-Dye2 0.4 μL、補(bǔ)水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,45個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min[13]。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析,用于驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR、巢式PCR 的檢測(cè)靈敏度

通過(guò)對(duì)濃度稀釋梯度為10-1～10-9的重組質(zhì)粒DNA樣品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：常規(guī)PCR和巢式PCR檢測(cè)方法均可快速、特異、靈敏地檢測(cè)出黃龍病菌的16S rDNA片段,常規(guī)PCR可在濃度梯度為10-1～10-5的5個(gè)重組質(zhì)粒DNA稀釋樣品中檢測(cè)出清晰的目標(biāo)條帶,其中對(duì)10-5稀釋的樣品檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)：凝膠電泳條帶非常微弱(圖1)。而巢式PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：10-5稀釋的樣品中仍可檢測(cè)到清晰的目標(biāo)條帶，10-6～10-8稀釋的DNA中亦能檢測(cè)到條帶。10-9稀釋模板后進(jìn)行檢測(cè),無(wú)清晰的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。表明巢式PCR方法的檢測(cè)靈敏度是普通PCR檢測(cè)方法的1 000倍(圖2)。

圖1 常規(guī)PCR在柑橘黃龍病菌檢測(cè)中的靈敏度測(cè)試

圖2 巢式PCR在柑橘黃龍病菌檢測(cè)中的靈敏度測(cè)試

2.2 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度

通過(guò)對(duì)濃度稀釋梯度為10-2～10-9的重組質(zhì)粒DNA樣品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR可在濃度梯度10-2～10-9的重組質(zhì)粒DNA模板中采集到陽(yáng)性信號(hào)(圖3)。反應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR在柑橘黃龍病菌檢測(cè)中的靈敏度測(cè)試

2.3 三種方法的檢測(cè)特異性驗(yàn)證

為驗(yàn)證本文常規(guī)PCR、巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)方法對(duì)柑橘黃龍病檢測(cè)的特異性,運(yùn)用3種檢測(cè)方法對(duì)本研究室保存的柑橘潰瘍病菌、柑橘炭疽病菌、辣椒疫霉菌(可危害柑橘)、柑橘衰退病病毒、柑橘碎葉病病毒及健康柑橘對(duì)照樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果均無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)；而3種檢測(cè)方法對(duì)感染黃龍病的柑橘樣品均可檢出陽(yáng)性反應(yīng)(表1)。

表1三種PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)柑橘黃龍病菌的檢測(cè)特異性驗(yàn)證
Table1SpecificitytestofthethreemoleculardetectionmethodsforHLB

樣品類(lèi)型Samplestype樣品數(shù)/個(gè)Samplesnumbers普通PCR檢出數(shù)/個(gè)DetectednumbersinconventionalPCR巢式PCR檢出數(shù)/個(gè)DetectednumbersinnestedPCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢出數(shù)/個(gè)Detectednumbersinq?PCR健康柑橘Healthycitrus6000柑橘炭疽病菌Citrusanthracnosepathogen6000辣椒疫霉菌Phytophthorapathogen6000柑橘衰退病Citrustristezadiseasesamples6000柑橘碎葉病Citrustatterleafvirussamples6000柑橘潰瘍病Citruscankerpathogen6000黃龍病罹病樣CitrusinfectedbyHLB6666

2.4 疑似黃龍病柑橘樣品的實(shí)際檢測(cè)

在廣東龍門(mén)、肇慶、云浮等地多個(gè)柑橘品種上采集疑似黃龍病的斑駁黃化葉片,取葉脈提取DNA,使用常規(guī)PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 3種檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3種檢測(cè)方法對(duì)田間的189個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果不同,陽(yáng)性樣品檢出數(shù)分別為：111、141、152,檢出率分別為58.7%、74.6%、80.4%。其檢測(cè)效果為：常規(guī)PCR<巢式PCR<實(shí)時(shí)熒光定量PCR(表2)。

表23種PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)廣東柑橘黃龍病疑似樣品與多種柑橘病原菌的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果
Table2DetectionofHLB-infectedsamplescollectedfromGuangdongbythethreemoleculardetectionmethods

來(lái)源地Origin樣品Samples樣品數(shù)/個(gè)Samplesnumbers普通PCR檢出數(shù)/個(gè)DetectednumbersinconventionalPCR巢式PCR檢出數(shù)/個(gè)DetectednumbersinnestedPCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢出數(shù)/個(gè)Detectednumbersinq?PCR龍門(mén)Longmen年橘Nianju23577砂糖橘Shatangju43283136肇慶Zhaoqing砂糖橘Shatangju26172123貢柑Gonggan47294143云浮Yunfu砂糖橘Shatangju157911臍橙Qicheng25172222陽(yáng)春Yangchun春甜橘Chuntianju1081010本研究室Ourlab健康柑橘Negativecontrol6000黃龍病罹病樣Positivecontrol6666

3 結(jié)論與討論

柑橘黃龍病樹(shù)有一些典型的癥狀,人們常以此來(lái)判斷黃龍病的發(fā)生。但癥狀診斷帶有很多主觀因素,且該病的癥狀與柑橘缺素癥、柑橘病毒病等有很多相似之處,因此診斷準(zhǔn)確率不高[6]。人們還開(kāi)發(fā)出了一些其他診斷方法,如：指示植物鑒定法、組織染色觀察法、電鏡切片觀察法、核酸雜交檢測(cè)法等,但這些方法或者檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜,或者檢測(cè)靈敏度不夠,難以直接應(yīng)用于黃龍病的田間實(shí)際檢測(cè)[8]。

PCR 技術(shù)具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn), 已成為當(dāng)前柑橘黃龍病檢測(cè)的主要手段。PCR技術(shù)主要有：普通PCR、巢式PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR[5]。這3種檢測(cè)方法對(duì)廣東省各種柑橘品種的田間檢測(cè)效果還缺少評(píng)價(jià)和報(bào)道。

本研究首先對(duì)比了3種PCR方法對(duì)柑橘黃龍病菌的檢測(cè)靈敏度。試驗(yàn)表明：普通PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法均可對(duì)黃龍病菌16S rDNA進(jìn)行有效檢測(cè),但其檢測(cè)靈敏度有所不同,依次為：常規(guī)PCR<巢式PCR <實(shí)時(shí)熒光定量PCR。在模板定量研究中發(fā)現(xiàn)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度是巢式PCR的10倍,而巢式PCR的靈敏度是普通PCR的1 000倍。

與實(shí)驗(yàn)室的理想條件不同,田間檢測(cè)樣品中混雜了很多柑橘基因組和一些可能干擾PCR反應(yīng)的抑制物[14]。對(duì)采自田間不同柑橘品種的樣品進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)：3種檢測(cè)方法可有效抵御抑制物對(duì)PCR反應(yīng)的影響,均可順利地在田間樣品中檢測(cè)出黃龍病菌。3 種PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)本研究室保存的柑橘潰瘍病菌、柑橘炭疽病菌、辣椒疫霉菌、柑橘衰退病病毒、柑橘碎葉病病毒及健康柑橘對(duì)照樣品均無(wú)陽(yáng)性反應(yīng),說(shuō)明這3種檢測(cè)方法的特異性較好。研究還發(fā)現(xiàn)：這3種檢測(cè)方法的田間檢測(cè)效果是：常規(guī)PCR<巢式PCR <實(shí)時(shí)熒光定量PCR。再次表明：田間條件下,實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)黃龍病菌仍有最高的檢測(cè)靈敏度,而普通PCR由于其靈敏度的限制,可能會(huì)在大規(guī)模檢測(cè)中出現(xiàn)一些漏檢,但其檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于實(shí)時(shí)熒光定量PCR,適合田間大規(guī)模檢測(cè)應(yīng)用。巢式PCR同時(shí)具有前兩者的一些優(yōu)點(diǎn),而其檢測(cè)成本和田間檢測(cè)效果介于普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR之間,但考慮到其實(shí)驗(yàn)操作較為繁瑣,且容易因開(kāi)管操作形成濺射氣溶膠而造成樣品污染,因此認(rèn)為該方法更適合技術(shù)熟練者使用[15]。

綜上,普通PCR得益于其較低的成本,適合用于大規(guī)模的田間初次普查檢測(cè)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR非常適合對(duì)普通PCR沒(méi)有檢出的疑似樣品進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn),或可對(duì)黃龍病菌侵染早期,含菌量較低的樣本,如種苗、接穗進(jìn)行定量檢測(cè)；巢式PCR同時(shí)具有前兩者的一些優(yōu)點(diǎn),但由于對(duì)操作的要求較高,適合經(jīng)驗(yàn)較為豐富的研究人員開(kāi)展試驗(yàn),且在試驗(yàn)中需嚴(yán)格遵守試驗(yàn)程序,確保試驗(yàn)用品的消毒,并嚴(yán)格控制樣品污染,從而避免假陽(yáng)性。

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Comparisonofcitrushuanglongbingmoleculardetectionmethods

Cheng Baoping, Peng Aitian, Song Xiaobing, Ling Jinfeng, Chen Xia

(PlantProtectionResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences;GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,Guangzhou510640,China)

Detection sensitivity and detection rate of conventional PCR, nested PCR and real-time quantitative PCR were compared for detection of citrus huanglongbing. The results showed that the detection sensitivity was ranked from high to low as real-time quantitative PCR>nested PCR>conventional PCR. Then total 189 suspected citrus samples from five different cultivars with symptom of HLB in orchard of Guangdong were amplified and confirmed by the three methods. The results indicated that the detection rate was ranked from high to low as real-time quantitative PCR>nested PCR>conventional PCR. This research indicated that conventional PCR, du to its low cost, could be used in large scale diagnosis of HLB disease, real-time quantitative PCR had the highest detection sensitivity, and nested-PCR had the advantages of the other two, but its experimental operation was more complex.

CandidatusLiberibacter asiaticus; conventional PCR; nested-PCR; real time quantitative PCR; comparative research

2013-11-18

：2014-02-09

廣東省農(nóng)業(yè)科技推廣專項(xiàng)資金重大技術(shù)研究項(xiàng)目(201201127);廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(粵農(nóng)[2009]380號(hào));廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)基金項(xiàng)目(201305);科技創(chuàng)新人才出國(guó)培養(yǎng)計(jì)劃(粵農(nóng)科[2013]74號(hào))

S 412

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.019

* 通信作者 E-mail：pengait@163.com