李春杰， 譚國(guó)忠， 王 義， 許艷麗*

(1.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 哈爾濱 150081;2. 美國(guó)Rutgers大學(xué)， 新澤西 08901)

寒區(qū)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)冷凍儲(chǔ)存條件優(yōu)化

李春杰1， 譚國(guó)忠1， 王 義2， 許艷麗1*

(1.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 哈爾濱 150081;2. 美國(guó)Rutgers大學(xué)， 新澤西 08901)

以我國(guó)高寒地區(qū)分離、篩選出的高致病力昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)嗜菌異小桿線蟲(chóng)(Heterorhabditisbacteriophora-HBN)為研究對(duì)象，對(duì)其冷凍儲(chǔ)存條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，介質(zhì)中不同含水量對(duì)線蟲(chóng)HBN的冷凍存活率有著顯著的影響；其中含水量為50%的蛭石中線蟲(chóng)回收率最高，為87.4%；冷凍儲(chǔ)存后的線蟲(chóng)經(jīng)4 ℃ 24 h+室溫1 h解凍利于線蟲(chóng)冷凍休眠后復(fù)蘇；線蟲(chóng)經(jīng)階段性降溫較直接降溫至-4 ℃的冷凍存活率提高31.6百分點(diǎn)；儲(chǔ)存介質(zhì)蛭石中采用滅菌自來(lái)水較適于HBN線蟲(chóng)在-4 ℃冷凍存活；7 d內(nèi)冷凍儲(chǔ)存增強(qiáng)了HBN線蟲(chóng)對(duì)寄主昆蟲(chóng)的侵入能力。

昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng); 冷凍儲(chǔ)存; 存活率; 侵入力

昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)(entomopathogenic nematode，EPN)是指體內(nèi)攜帶具有病原性的共生細(xì)菌能引起寄主昆蟲(chóng)致病的一類寄生性線蟲(chóng)，是昆蟲(chóng)的重要天敵類群，對(duì)200多種昆蟲(chóng)有致病作用[1]，這種新型生物殺蟲(chóng)劑具有廣闊的應(yīng)用前景。但該線蟲(chóng)常溫儲(chǔ)存貨架期短，是其推廣應(yīng)用的主要障礙因素之一。該線蟲(chóng)在低溫下處于靜止休眠狀態(tài)，新陳代謝速度減慢、體能消耗減少，從而可延長(zhǎng)線蟲(chóng)貨架期。所以，當(dāng)今學(xué)者們對(duì)低溫儲(chǔ)存尤為感興趣，但適于低溫儲(chǔ)存的材料和儲(chǔ)存技術(shù)尚未解決。

李春杰等[2]根據(jù)寒區(qū)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)在黑龍江省越冬的自然環(huán)境條件調(diào)查結(jié)果，對(duì)其室內(nèi)低溫儲(chǔ)存條件進(jìn)行了初步篩選，但如何提高線蟲(chóng)冷凍后的存活率仍需進(jìn)一步研究。儲(chǔ)存介質(zhì)種類和濕度、解凍方法、降溫速度和介質(zhì)中的溶液均影響著冷凍儲(chǔ)存后線蟲(chóng)的存活和線蟲(chóng)對(duì)寄主的侵染能力。不同種線蟲(chóng)對(duì)降溫速度表現(xiàn)出明顯的差異，蕪菁夜蛾斯氏線蟲(chóng)(Steinernemafeltiae)經(jīng)過(guò)直接降溫后，低溫存活率顯著提高；而嗜菌異小桿線蟲(chóng)(Heterorhabditisbacteriophora)經(jīng)過(guò)階段性降溫馴化后，其低溫存活率較直接降溫后的存活率明顯增加[3]。Grewal等[4]的研究表明，階段性降溫使斯氏線蟲(chóng)S.carpocapsae和S.riobrave所獲得的耐寒性好于直接降溫。適宜的滲透壓可使線蟲(chóng)慢速脫水，有利于線蟲(chóng)的儲(chǔ)存[5-6]。楊秀芬等[7]的試驗(yàn)證實(shí)了低溫誘導(dǎo)有助于培育斯氏線蟲(chóng)適應(yīng)0 ℃以上的低溫特性，但返回25 ℃培養(yǎng)2個(gè)侵染循環(huán)后這種特性有不同程度的喪失。

很多研究者通過(guò)多種方法可提高昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)在0 ℃以上暫時(shí)的耐寒性，而作者以我國(guó)高寒地區(qū)分離、篩選的高致病力線蟲(chóng)為研究對(duì)象，該線蟲(chóng)對(duì)寒冷地區(qū)生態(tài)適應(yīng)能力強(qiáng)。根據(jù)該線蟲(chóng)能在黑龍江省越冬的自然現(xiàn)象及其低溫儲(chǔ)存潛力挖掘[2,8]，其耐寒性和室內(nèi)儲(chǔ)存溫度、介質(zhì)的種類和線蟲(chóng)的儲(chǔ)存濃度等已得到初步探索[9-11]，通過(guò)進(jìn)一步對(duì)線蟲(chóng)冷凍儲(chǔ)存條件進(jìn)行優(yōu)化，試圖提高冷凍后的存活率，以挖掘冷凍儲(chǔ)存潛力，為改善昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)儲(chǔ)存技術(shù)提供依據(jù)，從而加快我國(guó)寒區(qū)高致病力線蟲(chóng)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用速度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試線蟲(chóng)

從黑龍江省哈爾濱市松樹(shù)下土壤中分離得到的高致病力的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)，由加拿大線蟲(chóng)博物館鑒定，為嗜菌異小桿線蟲(chóng)哈爾濱品系[H.bacteriophora-HBN(HBN)]。供試寄主昆蟲(chóng)為大蠟螟(Galleriamellonella)幼蟲(chóng),從天津中墾進(jìn)出口公司購(gòu)買。

1.1.2 試驗(yàn)儀器和器皿

DHP-9162 a恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、BCD-226 sTV控溫冰箱(青島海爾股份有限公司)、S633069冷光源解剖鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)、LDZX-40 sCI高壓滅菌器(上海市申安醫(yī)療器械廠)、200 mL玻璃瓶、直徑60 mm的塑料培養(yǎng)皿、直徑90 mm的玻璃培養(yǎng)皿和12孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 儲(chǔ)存介質(zhì)對(duì)線蟲(chóng)的冷凍存活及回收率的影響

選擇蛭石、海綿、沙土(沙和土質(zhì)量比為1∶1)和珍珠巖4種介質(zhì)。試驗(yàn)所用的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)HBN采用White-Trap繁殖法[12-13]，新繁殖出來(lái)的線蟲(chóng)于10 ℃保存7 d備用。稱取不同介質(zhì)各10 g裝在200 mL玻璃瓶?jī)?nèi)，根據(jù)目前該實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同儲(chǔ)存介質(zhì)含水量初篩結(jié)果[8]，每種介質(zhì)設(shè)4個(gè)不同含水量(按介質(zhì)和水的質(zhì)量比)，蛭石含水量設(shè)40%、50%、60%、70%，海綿含水量設(shè)20%、30%、40%、50%，沙土含水量設(shè)8%、10%、12%、14%，珍珠巖水量設(shè)80%、90%、100%、110%，共16個(gè)處理，每個(gè)處理6瓶，每瓶分別加入105條HBN侵染期線蟲(chóng)。將所有處理直接于-4 ℃儲(chǔ)存5 d，然后拿出玻璃瓶于室溫1 h后收集介質(zhì)中線蟲(chóng)。介質(zhì)為蛭石、海綿和珍珠巖的用80目和500目套篩過(guò)濾，收集500目上的線蟲(chóng)懸浮液，懸液再用蔗糖梯度離心法[14]，收集各處理中的線蟲(chóng)，沙土中的線蟲(chóng)直接用蔗糖梯度離心法收集。每種介質(zhì)中選擇線蟲(chóng)存活率最高的1個(gè)含水量，計(jì)算回收到的線蟲(chóng)占起初存放介質(zhì)中線蟲(chóng)量的比例，即回收率。在解剖鏡下調(diào)查收集到線蟲(chóng)的存活率。

1.2.2 解凍方法對(duì)線蟲(chóng)冷凍存活的影響

向含水量為50%的10 g蛭石中加入105條HBN侵染期線蟲(chóng)，共18瓶。-4 ℃直接冷凍5 d，然后按不同方法解凍，(1)室溫解凍24 h：把冷凍后的樣品直接放在室溫下解凍24 h；(2)水中直接解凍：室溫下直接加水、浸泡1 h解凍；(3)4 ℃解凍24 h：把冷凍后的樣品放在4 ℃冰箱中解凍24 h，然后再置于室溫1 h。6瓶為一個(gè)處理，分別采用不同方法解凍，收集解凍后樣品中的線蟲(chóng)，顯微鏡下記錄線蟲(chóng)的存活情況，計(jì)算冷凍后經(jīng)不同方法解凍后線蟲(chóng)的存活率。

1.2.3 降溫方式對(duì)介質(zhì)中線蟲(chóng)冷凍存活的影響

稱取蛭石、沙土(1∶1)、海綿和珍珠巖各10 g裝在玻璃瓶?jī)?nèi)，每種中介質(zhì)線蟲(chóng)儲(chǔ)存濃度均為104條/g，選擇4種介質(zhì)中線蟲(chóng)存活率最高的含水量分別為12%、50%、30%和100%。每個(gè)處理12瓶，共48瓶，平均分成兩組，一組降溫方式為直接降溫法，即直接于-4 ℃儲(chǔ)存5 d，另一組為階段式降溫，以1 ℃/10 min速度降溫，于-1 ℃存放1 h，然后再以1 ℃/10 min速度降溫至-4 ℃儲(chǔ)存5 d[10-11]。然后升溫至4 ℃保持24 h，于室溫放置1 h后調(diào)查其存活率。

1.2.4 介質(zhì)中溶液對(duì)線蟲(chóng)冷凍存活的影響

介質(zhì)中溶液設(shè)置滅菌蒸餾水(SDW)、非滅菌自來(lái)水(ATW)、滅菌自來(lái)水(SATW)、0.1 mol/L的NaCl和M9 Buffer 5種不同溶液進(jìn)行-4 ℃儲(chǔ)存5 d，降溫方式采用階段式降溫法，解凍方法采用4 ℃解凍24 h再室溫1 h的方式，顯微鏡下記錄線蟲(chóng)的存活情況，計(jì)算不同溶液中冷凍后線蟲(chóng)的存活率。

M9 Buffer：Na2HPO46 g， KH2PO43 g， NaCl 5 g， MgSO40.128 g， DDW 1 L，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2.5 冷凍對(duì)線蟲(chóng)侵入寄主能力的影響

將大蠟螟末齡幼蟲(chóng)放入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔一頭幼蟲(chóng)，孔內(nèi)墊有2層濕潤(rùn)濾紙。將冷凍3、5和7 d后收集的活線蟲(chóng)與大蠟螟幼蟲(chóng)按5∶1接種，以未經(jīng)冷凍處理的線蟲(chóng)HBN作為對(duì)照，共5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)板。接種后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，48 h從細(xì)胞培養(yǎng)板中取出死亡大蠟螟幼蟲(chóng)，用清水沖洗。置于25 ℃培養(yǎng)箱中，48 h后解剖死亡大蠟螟幼蟲(chóng)，解剖鏡下檢查大蠟螟幼蟲(chóng)體內(nèi)的雌蟲(chóng)數(shù)量，雌蟲(chóng)是由侵入大蠟螟幼蟲(chóng)體內(nèi)的侵染期線蟲(chóng)發(fā)育而成，從而可計(jì)算出線蟲(chóng)的侵入率。

侵入率(%)=侵入大蠟螟體內(nèi)的雌蟲(chóng)數(shù)/侵染每頭大蠟螟所用的線蟲(chóng)數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，調(diào)查的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理和SPSS 11.5軟件分析，計(jì)算所得百分?jǐn)?shù)經(jīng)反正弦平方根轉(zhuǎn)換，然后采用單因素0.05水平方差分析(One-Way ANOVA)和LSD多重比較檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲(chǔ)存介質(zhì)對(duì)線蟲(chóng)的冷凍存活及回收率的影響

2.1.1 介質(zhì)含水量對(duì)線蟲(chóng)冷凍存活率的影響

不同種儲(chǔ)存介質(zhì)中的線蟲(chóng)冷凍后存活率存在差異，其中珍珠巖中的最高存活率顯著低于其他3種介質(zhì)中的最高存活率。不同含水量介質(zhì)對(duì)HBN線蟲(chóng)低溫儲(chǔ)存后的存活率也有著明顯影響。含水量為50%的蛭石中線蟲(chóng)存活率最高，為47.6%，含水量為70%的蛭石中線蟲(chóng)存活率最低，為27.9%(圖1a)；含水量30%的海綿中線蟲(chóng)存活率最高，為41.5%，含水量50%時(shí)線蟲(chóng)存活率最低，為15.6%(圖1b)；含水量12%的沙土中線蟲(chóng)存活率最高，為50.3%，含水量14%時(shí)線蟲(chóng)存活率最低，為20.9%(圖1c)；含水量100%的珍珠巖中線蟲(chóng)存活率最高，為34.3%，含水量80%時(shí)線蟲(chóng)存活率最低，為13.7%(圖1d)。可見(jiàn)4種介質(zhì)中線蟲(chóng)最高存活率和最低存活率之間差異均顯著(P<0.05)，并且除珍珠巖外其他3種介質(zhì)中含水量最高的線蟲(chóng)存活率最低。

圖1 介質(zhì)含水量對(duì)線蟲(chóng)冷凍存活率的影響

2.1.2 儲(chǔ)存介質(zhì)對(duì)線蟲(chóng)回收率的影響

選擇4種介質(zhì)中存活率最高的一種含水量，計(jì)算介質(zhì)中HBN線蟲(chóng)的回收率，結(jié)果顯示(圖2)，含水量50%蛭石中的線蟲(chóng)回收率最高，為87.4%，其次是含水量12%的沙土為75%，含水量100%珍珠巖為58.3%，含水量30%的海綿為14.7%。只有回收率高才有利于線蟲(chóng)的高效應(yīng)用，即應(yīng)用時(shí)從介質(zhì)中釋放線蟲(chóng)效率高。因?yàn)楹繛?0%蛭石中的線蟲(chóng)存活率和回收率均最高，所以含水量為50%的蛭石較適合HBN的-4 ℃冷凍儲(chǔ)存?？赡苁怯捎诓煌橘|(zhì)的結(jié)構(gòu)不同使線蟲(chóng)向外游離時(shí)所受阻力不同，導(dǎo)致線蟲(chóng)游離速度不同。

圖2 不同儲(chǔ)存介質(zhì)對(duì)H. bacteriophora-HBN回收率的影響

2.2 解凍方法對(duì)線蟲(chóng)存活的影響

含水量為50%蛭石中的HBN線蟲(chóng)于-4 ℃直接冷凍5 d后，分別經(jīng)過(guò)不同方法解凍。其中，4 ℃解凍24 h后再置于室溫1 h后線蟲(chóng)存活率最高，為59.8%(圖3)，于室溫解凍24 h后線蟲(chóng)存活率次之，為45.5%，水中直接解凍線蟲(chóng)存活率最低，為37.4%。試驗(yàn)表明線蟲(chóng)在冷凍后需要一定的解凍條件，才能恢復(fù)其活性，但不同的解凍條件對(duì)線蟲(chóng)復(fù)蘇后的存活率有一定影響?？梢钥闯?種解凍方式中，4 ℃24 h的解凍方式有利于線蟲(chóng)HBN的冷凍存活，直接于室溫解凍和水中直接解凍線蟲(chóng)存活率較低。

2.3 降溫方式對(duì)介質(zhì)中線蟲(chóng)冷凍存活的影響

2.3.1 最佳含水量的不同介質(zhì)對(duì)線蟲(chóng)冷凍存活的影響

兩組線蟲(chóng)于-4 ℃冷凍5 d后，回收4種介質(zhì)中的線蟲(chóng)HBN，顯微鏡下線蟲(chóng)存活率調(diào)查結(jié)果顯示(圖4)，不同儲(chǔ)存介質(zhì)對(duì)HBN冷凍存活的影響很明顯。經(jīng)過(guò)階段性降溫后再-4 ℃儲(chǔ)存的一組，含水量為50%的蛭石中HBN存活率最高，為79.2%，其次含水量30%的海綿中HBN存活率為77.2%，含水量12%的沙土為70.1%，含水量100%珍珠巖為35.6%。復(fù)蘇后鏡下觀察蛭石和海綿中的線蟲(chóng)活動(dòng)較沙土和珍珠巖中的線蟲(chóng)活躍很多，分析原因可能是沙土和珍珠巖中儲(chǔ)存的線蟲(chóng)因缺氧而窒息，尤其是珍珠巖中的線蟲(chóng)活動(dòng)能力很差?？梢钥闯龊?0%的蛭石中和含水量30%的海綿宜于HBN的冷凍儲(chǔ)存。

圖3 解凍方式對(duì)HBN線蟲(chóng)存活率的影響

圖4 介質(zhì)和降溫方式對(duì)H. bacteriophora-HBN 冷凍存活率的影響

2.3.2 降溫速度對(duì)線蟲(chóng)冷凍存活的影響

降溫速度對(duì)線蟲(chóng)HBN在-4 ℃下儲(chǔ)存5 d的冷凍存活有著明顯的影響(圖4)。除了含水量100%珍珠巖外，采用階段性降溫法的3種儲(chǔ)存介質(zhì)中的線蟲(chóng)冷凍存活率顯著高于直接降溫法(P<0.05)。含水量為50%的蛭石中HBN較直接降溫的存活率高出31.6百分點(diǎn)，在含水量為30%的海綿中較直接降溫的存活率高出35.7百分點(diǎn)，在含水量為12%的沙土中較直接降溫的存活率高出19.8百分點(diǎn)，在含水量為100%珍珠巖中HBN較直接降溫的存活率僅高出1.3百分點(diǎn)?？梢钥闯霾捎弥鸩骄徛禍胤ㄓ欣诤繛?0%的蛭石、30%的海綿和12%的沙土中HBN線蟲(chóng)體內(nèi)脫水休眠，提高其冷凍存活率。

2.4 介質(zhì)中溶液對(duì)線蟲(chóng)冷凍存活的影響

含50%滅菌自來(lái)水的蛭石中線蟲(chóng)HBN存活率最高，為79.2%，顯著高于未滅菌自來(lái)水(圖5)，但與M9 Buffer、0.1 mol/L NaCl和滅菌蒸餾水差異不顯著。

圖5 不同液體滲透壓對(duì)H. bacteriophora-HBN冷凍存活的影響

2.5 冷凍儲(chǔ)存后對(duì)線蟲(chóng)侵入寄主能力的影響

冷凍后HBN線蟲(chóng)侵入大蠟螟體內(nèi)的比例較未冷凍的明顯增加(圖6)。-4 ℃冷凍3、5和7 d后線蟲(chóng)侵入率均達(dá)40%以上，差異不顯著，但均顯著高于未冷凍(CK)的侵入率(P<0.05)，并較未冷凍的侵入率高出10百分點(diǎn)以上。

圖6 冷凍后HBN線蟲(chóng)對(duì)大蠟螟的侵入率

3 討論

從昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)分布來(lái)看，嗜菌異小桿線蟲(chóng)在加拿大、丹麥、愛(ài)爾蘭和俄羅斯等地均有分布[1]，可以看出昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)能夠忍受0 ℃以下的低溫，并在這些寒冷地區(qū)長(zhǎng)期生存。而在中國(guó)曾在廣東、山東和河北分離到嗜菌異小桿線蟲(chóng)[15-16]，筆者雖然在黑龍江省已經(jīng)分離到了嗜菌異小桿線蟲(chóng)[2]，但對(duì)其耐寒性的利用值得探討。該研究表明寒區(qū)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)HBN于-4 ℃的最佳儲(chǔ)存介質(zhì)為含水量50%的蛭石，該介質(zhì)利于線蟲(chóng)的冷凍存活和應(yīng)用時(shí)的釋放；采用階段性降溫和冷凍后采用4 ℃ 24 h再置于室溫的解凍方法，冷凍過(guò)程中介質(zhì)中的溶液采用滅菌自來(lái)水，這些條件較適合線蟲(chóng)在低溫下脫水和解凍時(shí)復(fù)原，更利于線蟲(chóng)HBN的冷凍存活，并且-4 ℃下冷凍儲(chǔ)存7 d內(nèi)線蟲(chóng)對(duì)寄主昆蟲(chóng)的侵染活性增強(qiáng)。該研究結(jié)果將為寒區(qū)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)實(shí)行低溫儲(chǔ)存提供可靠依據(jù)，為該線蟲(chóng)的研發(fā)及今后當(dāng)?shù)睾οx(chóng)防治打下良好基礎(chǔ)。

線蟲(chóng)的脫水能力在其冷凍存活過(guò)程中起著重要的作用，低濕休眠狀態(tài)極利于無(wú)脊椎動(dòng)物的冷凍存活[17]。低濕休眠利于線蟲(chóng)的長(zhǎng)期儲(chǔ)存，可提高Steinernemacarpocapsae的存活率，延長(zhǎng)壽命3個(gè)月，也提高了它對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)性[3]。儲(chǔ)存介質(zhì)及介質(zhì)含水量對(duì)線蟲(chóng)的脫水速度有著很大的影響。因?yàn)榻橘|(zhì)中含水量大，不利于線蟲(chóng)冷凍過(guò)程中體內(nèi)向外脫水進(jìn)入休眠，線蟲(chóng)體內(nèi)較大的含水量使線蟲(chóng)體內(nèi)迅速結(jié)冰，細(xì)胞體積膨大至破裂，最終導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡。由于不同介質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同使其蓄水能力和含氧量不同，影響了線蟲(chóng)的冷凍存活。提高病原線蟲(chóng)存活率有多種方法，通過(guò)利用甘油和離子溶液混合可增強(qiáng)線蟲(chóng)S.carpocapsae‘All’的耐寒性[5]。Chen和Glazer[18]通過(guò)逐漸增加溶液滲透壓提高線蟲(chóng)的存活率。該研究中0.1 mol/L的NaCl中的HBN于-4 ℃冷凍5 d的存活率稍高于人工自來(lái)水中的HBN，但又稍低于滅菌人工自來(lái)水?？赡苁荕9 Buffer和0.1 mol/L NaCl中的離子濃度偏高，使得線蟲(chóng)體內(nèi)脫水過(guò)多而干死，滅菌蒸餾水中離子濃度太低，不利于線蟲(chóng)體內(nèi)的冷凍脫水，使得線蟲(chóng)冷凍過(guò)程中體內(nèi)結(jié)冰致死。

Wharton等[19]認(rèn)為線蟲(chóng)的低溫存活率與冷卻速率有關(guān)。在快速結(jié)冰環(huán)境中，部分線蟲(chóng)由于不斷增長(zhǎng)的冰晶而受到機(jī)械損傷，造成體內(nèi)物質(zhì)從皮層傷口處流出，而較慢的冷卻速率可以抑制接種性結(jié)冰，有助于線蟲(chóng)低溫存活。同時(shí)，緩慢降溫使線蟲(chóng)產(chǎn)生保護(hù)性脫水，進(jìn)行低濕休眠。試驗(yàn)中階段性降溫利于線蟲(chóng)體內(nèi)脫水進(jìn)入低濕休眠，也證實(shí)了以前學(xué)者的觀點(diǎn)。同樣，線蟲(chóng)的冷凍存活率也受到解凍速度的影響。由于線蟲(chóng)在經(jīng)歷低溫后進(jìn)入休眠狀態(tài)，低溫過(guò)程中線蟲(chóng)脫去體內(nèi)多余的水，以防止發(fā)生結(jié)冰造成傷害，而迅速升溫后線蟲(chóng)吸水，細(xì)胞急劇膨脹，破壞了細(xì)胞膜的彈性，最終細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡，存活率降低。所以緩慢升溫利于細(xì)胞的復(fù)原。

通過(guò)蒸發(fā)脅迫[20]和高滲脫水[21]，侵染期小卷蛾斯氏線蟲(chóng)(S.carpocapsae)安全脫水休眠，加水后脫水休眠的線蟲(chóng)在1 h 內(nèi)復(fù)蘇后侵染力沒(méi)有受到不良影響。Brown等[22]報(bào)道了S.riobravis、S.carpocapsae和S.glaseri3種線蟲(chóng)經(jīng)低溫處理后，線蟲(chóng)的侵染力沒(méi)有顯著變化。通常情況下，昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)無(wú)論接種量多少，由于線蟲(chóng)間的相互競(jìng)爭(zhēng)，只有一部分個(gè)體表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵染能力，而其他的線蟲(chóng)處于非活躍狀態(tài)。該試驗(yàn)中0 ℃以下的低溫儲(chǔ)存過(guò)程中線蟲(chóng)消耗了體能，解凍后線蟲(chóng)處于饑渴狀態(tài)，侵入寄主取食的欲望更加強(qiáng)烈，所以短期冷凍儲(chǔ)存增強(qiáng)了HBN線蟲(chóng)的侵染活性。

本研究利用耐寒性很強(qiáng)的寒區(qū)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)，對(duì)其冷凍儲(chǔ)存條件的進(jìn)一步篩選，得到了適宜的儲(chǔ)存介質(zhì)、介質(zhì)中的溶液和降溫方式，但是關(guān)于該昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的耐寒機(jī)制還不清楚，如受低溫脅迫線蟲(chóng)體內(nèi)產(chǎn)生的一系列生理生化反應(yīng)，包括脅迫脫水、改變代謝酶活性、飽和脂肪酸轉(zhuǎn)換為非飽和脂肪酸、累積海藻糖以及合成新同工酶等[23]。受低溫脅迫時(shí)還涉及一系列相關(guān)基因的激活與沉默，最終體現(xiàn)為線蟲(chóng)對(duì)環(huán)境脅迫的耐受能力，這是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控體系，需要逐步探索。

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OptimizingfreezingstorageconditionsfortheentomopathogenicnematodeisolatedfromthecoldregioninChina

Li Chunjie1, Tan Guozhong1, Wang Yi2, Xu Yanli1

(1.KeyLaboratoryofMollisolsAgroecology,NortheastInstituteofGeographyandAgroecology,ChineseAcademyofSciences,Harbin150081,China; 2.RutgersUniversity,NewJersey08901,USA)

One high-virulence strain of EPNs,Heterorhabditisbacteriophora-HBN (HBN) with cold tolerance isolated from Harbin City was used in the laboratory in this study. Storage substance species and moisture, cooling rate, thawing ways and osmotic pressure of solution in the substances were optimized. The results showed that freezing survival of HBN were significantly affected by the substances with different water contents. Recycling coefficient ofH.bacteriophora-HBN in the vermiculite with water content of 50% was the highest (87.4%). The way of freezing HBN at room temperature for 1h following 4 ℃ for 24h was in favor of thawing of freezing dormancy. Freezing survival rate of HBN by phasic cooling pattern was increased by 31.6 percent than by direct cooling to -4 ℃. Sterilized artificial tap water in vermiculite was conducive to anhydrobiosis of HBN. The ability of HBN infectingGalleriamellonellawas enhanced in the short-term freezing storage in seven days.

entomopathogenic nematode; freezing storage; survival rate; infective ability

2013-10-15

：2014-01-25

國(guó)家科技計(jì)劃農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2007GB24910482)；中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目(KSCX2-YW-N-092)；黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(QC2010070)；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目(2009RFQYN092)

S 476.15

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.009

致謝：感謝加拿大線蟲(chóng)博物館郁慶館長(zhǎng)在線蟲(chóng)鑒定工作方面給予的幫助。

* 通信作者 E-mail: xyll@neigaehrb.ac.cn