蘇 丹， 呂國(guó)忠， 周如軍， 楊 紅， 傅俊范*

(1. 大連民族學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院, 大連 116600; 2. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110866)

白頭翁葉斑病菌黑色素的理化性質(zhì)及其生物合成途徑初步研究

蘇 丹1， 呂國(guó)忠1， 周如軍2， 楊 紅1， 傅俊范2*

(1. 大連民族學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院, 大連 116600; 2. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110866)

對(duì)白頭翁葉斑病菌胞壁結(jié)合黑色素和胞外黑色素進(jìn)行了理化性質(zhì)和紅外光譜掃描測(cè)定，結(jié)果表明兩者具有相似的理化性質(zhì)，均易溶于KOH、H2O2和NaClO，不溶于水、乙醇和丙酮。紅外光譜分析表明，白頭翁葉斑病菌YS-24菌株的胞壁結(jié)合黑色素與胞外黑色素為同一種類(lèi)型的黑色素。DHN黑色素的特異性抑制劑—三環(huán)唑，對(duì)白頭翁葉斑病菌黑色素的產(chǎn)生有明顯的抑制作用；以白頭翁葉斑病菌基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，得到了聚酮體合成酶基因的同源片段AaPKS，初步推斷白頭翁葉斑病菌黑色素合成屬于DHN途徑。

白頭翁葉斑病菌； 黑色素； 紅外光譜掃描； DHN途徑

白頭翁(Pulsatillachinensis)為毛茛科白頭翁屬多年生草本植物，其根可入藥[1]。白頭翁作為中藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒，味苦，具有涼血止痢、燥濕殺蟲(chóng)的功效[2]，藥理研究表明其有抗微生物、抗蔗糖酶、抗腫瘤等活性[3]。白頭翁葉斑病(windflower leaf spot)由銀蓮花殼二孢(Ascochytaanemones)引起，是目前影響白頭翁生產(chǎn)最為嚴(yán)重的病害之一，在白頭翁整個(gè)生育期中只要溫度、濕度適宜，其葉片、葉柄、莖均可受到感染發(fā)病，病田率可高達(dá)100%[4]。

黑色素(melanin)是一種廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中的無(wú)定形小顆粒狀的類(lèi)多酚聚合體，按其合成途徑的不同可分為 γ-谷氨酰胺酰-3,4-對(duì)苯二酚(GHB)、兒茶酚、多巴(DOPA)和多聚二羥萘(DHN)4 種。目前報(bào)道較多的是DOPA和DHN，且兩者存在相似的理化性質(zhì)，其中DHN黑色素普遍存在于半知菌和子囊菌等真菌中[5]。對(duì)許多植物病原真菌而言，DHN黑色素被認(rèn)為是重要的毒力因子，對(duì)病原物—寄主互作產(chǎn)生影響[6]。

聚酮體合成酶作為DHN黑色素合成第一步的催化酶發(fā)揮著非常重要的作用，Moriwaki等從稻平臍蠕孢(Bipolarisoryzae)中分離得到一個(gè)合成黑色素必需的聚酮體合成酶基因PKS1，發(fā)現(xiàn)近紫外線(300～400 nm)照射會(huì)加強(qiáng)其表達(dá)[8]；另外，從Ascochytarabiei中分離到的ArPKS1基因參與合成黑色素，ArPKS1缺失突變體的分生孢子器對(duì)紫外線表現(xiàn)出很強(qiáng)的敏感性[9]，本研究利用PCR擴(kuò)增技術(shù)得到了白頭翁葉斑病菌PKS基因的同源片段，并定名為AaPKS基因。

殺真菌劑三環(huán)唑(tricyclazole)是DHN黑色素合成的特異性抑制劑，能夠抑制DHN黑色素合成過(guò)程中的兩步脫氫反應(yīng)(1, 3, 6, 8-四羥基萘還原為小柱孢酮scytalone；1, 3, 8-三羥基萘還原為柱孢醌vermelone)，導(dǎo)致真菌黑色素合成受阻，產(chǎn)生的色素由黑褐色變成紅棕色。例如，三環(huán)唑能夠有效抑制稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、瓜類(lèi)炭疽病菌(Colletotrichumlagenarium)等多種真菌黑色素的生物合成[10]。筆者對(duì)白頭翁葉斑病菌黑色素的理化性質(zhì)及生物合成途徑進(jìn)行了研究，為其致病機(jī)理的深入研究及新型殺真菌劑的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：白頭翁葉斑病菌(A.anemones)菌株YS-24，由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物病害研究室分離鑒定并保存。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，水1 000 mL)和PD培養(yǎng)液(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL)。

供試藥劑：三環(huán)唑(純度達(dá)98%以上)由大連瑞澤農(nóng)藥股份有限公司生產(chǎn)。

供試試劑：標(biāo)準(zhǔn)品DOPA黑色素，購(gòu)于Sigma公司。

1.2 白頭翁葉斑病菌黑色素的制備與純化

1.2.1 胞壁結(jié)合黑色素的提取

參照蘋(píng)果黑星病菌黑色素的提取方法[11]，提取白頭翁葉斑病菌細(xì)胞壁中的黑色素。

1.2.2 胞外黑色素的提取

將菌株YS-24接種于裝有150 mL PD培養(yǎng)液的三角瓶中，25 ℃黑暗靜置培養(yǎng)30 d。培養(yǎng)結(jié)束后離心得上清液，濾液用7 mol/L HCl調(diào)至pH 2.0～3.0，靜置24 h后，10 000 r/min離心20 min，沉淀為胞外黑色素粗提物。

1.2.3 白頭翁葉斑病菌黑色素的純化

將黑色素粗提物與7 mol/L HCl充分混勻，沸水浴2 h，12 000 r/min離心10 min，沉淀用1 mol/L KOH溶解，再用7 mol/L HCl調(diào)溶液至pH 2.0，12 000 r/min離心10 min，按照上述步驟重復(fù)3次，沉淀用0.01 mol/L HCl、蒸餾水依次洗滌，1 000 r/min離心20 min，所得沉淀55 ℃烘干至恒重，干燥器內(nèi)干燥24 h后，-20 ℃保存。

1.3 白頭翁葉斑病菌黑色素理化性質(zhì)測(cè)定

參照玉米大斑病菌黑色素理化性質(zhì)的測(cè)定方法[12]，測(cè)定白頭翁葉斑病菌黑色素和標(biāo)準(zhǔn)品黑色素的理化性質(zhì)。

1.4 黑色素紅外光吸收光譜分析

稱取純化后的黑色素樣品2 mg與500 mg干燥的KBr混勻，在瑪瑙研缽中進(jìn)行研磨，用YP-2壓片機(jī)壓片后，在PerkinElmer Spectrum 65傅立葉紅外光譜儀上400～4 000 cm-1區(qū)間進(jìn)行紅外光譜掃描，并與標(biāo)準(zhǔn)品DOPA黑色素的紅外吸收光譜進(jìn)行比較分析。

1.5 三環(huán)唑?qū)Π最^翁葉斑病菌黑色素產(chǎn)生的影響

稱取純品三環(huán)唑添加至150 mL PDA 培養(yǎng)基中，至終濃度分別為10、25、50、100 μg/mL。接入經(jīng)活化的白頭翁葉斑病菌YS-24菌餅，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，以不添加三環(huán)唑的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，10 d后觀察并測(cè)量各處理菌落生長(zhǎng)情況。

1.6 白頭翁葉斑病菌聚酮合成酶PKS基因同源片段的擴(kuò)增

利用DNAMAN軟件，根據(jù)已知的構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、展青霉(Penicilliumpatulum)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等病原真菌PKS基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物PKS3:5′-GATGCCAAAGAAAGCTGGTC-3′和PKS4:5′-CATGGCGCAGACATTAAGA-3′，擴(kuò)增白頭翁葉斑病菌的PKS基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 白頭翁葉斑病菌黑色素理化性質(zhì)研究

白頭翁葉斑病菌胞內(nèi)、胞外黑色素均與標(biāo)準(zhǔn)品黑色素理化性質(zhì)相似。它們均溶于1 mol/L KOH(100 ℃)、30% H2O2和3.5% NaClO，而不溶于水、有機(jī)溶劑乙醇和丙酮。

表1 白頭翁葉斑病菌黑色素理化性質(zhì)1)Table 1 Physicochemical property of melaninproduced by A.anemones

1) “+”表示反應(yīng)；“-”表示不反應(yīng)。 “+”reactive；“-”unreactive.

2.2 白頭翁葉斑病菌黑色素紅外光譜分析

由紅外光譜圖(圖1a～b)可知，白頭翁葉斑病菌菌株YS-24的胞壁結(jié)合黑色素和胞外黑色素紅外光譜圖一致，說(shuō)明胞內(nèi)黑色素和胞外黑色素為同一種類(lèi)型的黑色素。

白頭翁葉斑病菌黑色素紅外光譜中：2 900～2 930 cm-1處強(qiáng)吸收峰和2 820～2 860 cm-1處強(qiáng)吸收峰為脂肪族C-H伸縮振動(dòng)峰，1 600～1 630 cm-1的較強(qiáng)吸收峰為C=O峰，與文獻(xiàn)報(bào)道的蘋(píng)果黑星病菌(Venturiainaequalis)中的DHN黑色素吸收峰一致[11]；而標(biāo)準(zhǔn)品DOPA黑色素的紅外光譜中(圖1c)，3 300～3 400 cm-1處有較寬吸收峰，由NH2中的N-H的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，1 590～1 610 cm-1附近強(qiáng)吸收峰，為C=C伸縮振動(dòng)峰(DOPA黑色素特征吸收峰)，白頭翁葉斑病菌黑色素缺少該峰，由以上結(jié)果可知，白頭翁葉斑病菌產(chǎn)生的胞壁黑色素和胞外黑色素與DHN黑色素相似，不同于DOPA黑色素。

2.3 三環(huán)唑?qū)Π最^翁葉斑病菌黑色素產(chǎn)生的影響

三環(huán)唑?yàn)镈HN黑色素合成的特異性抑制劑。不添加三環(huán)唑培養(yǎng)的白頭翁葉斑病菌菌落呈黑褐色，分生孢子細(xì)胞壁中沉積一層電子密度較高的黑色素。而三環(huán)唑在濃度10～100 μg/mL范圍內(nèi)均能抑制白頭翁葉斑病菌黑色素的產(chǎn)生，濃度僅為10 μg/mL時(shí)，即可使菌落顏色發(fā)生變化，菌落呈現(xiàn)紅棕色(圖2)，說(shuō)明該病菌對(duì)三環(huán)唑十分敏感。由此可以推斷白頭翁葉斑病菌黑色素合成主要是通過(guò)DHN途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖1 白頭翁葉斑病菌黑色素與DOPA黑色素的紅外掃描光譜Fig.1 Infrared spectra of A.anemones melanin and DOPA melanin

2.4 白頭翁葉斑病菌聚酮體合成酶PKS基因同源片段的克隆

利用特異性引物PKS3和PKS4對(duì)白頭翁葉斑病菌YS-24基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條3 000 bp左右的條帶(圖3)，回收測(cè)序得到長(zhǎng)度為3 503 bp的序列，與預(yù)測(cè)片段大小一致,定名為AaPKS。經(jīng)NCBI網(wǎng)站nucleotide BLAST比對(duì)，證實(shí)此片段與蠶豆殼二孢(A.fabae，GenBank登錄號(hào)為GQ150544)和鷹嘴豆殼二孢(A.rabiei，GenBank登錄號(hào)為GQ150552)的PKS基因核苷酸序列具有高度的同源性，分別為88%和86%，進(jìn)一步說(shuō)明了白頭翁葉斑病菌黑色素合成屬于DHN途徑。

圖2 三環(huán)唑?qū)Π最^翁葉斑病菌黑色素產(chǎn)生的影響Fig.2 Effects of tricyclazole on melanin production of A.anemones

圖3 白頭翁葉斑病菌聚酮體合成酶PKS基因同源片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of AaPKS homologousgene of A.anemones

3 結(jié)論與討論

黑色素在動(dòng)物、植物和微生物中廣泛存在，不同生物體內(nèi)的黑色素具有不同的種類(lèi)和功能[13]。黑色素不僅可以提高真菌在一定環(huán)境下的生存和競(jìng)爭(zhēng)能力，而且還是一些植物病原真菌重要的致病因子。因此，明確白頭翁葉斑病菌黑色素的種類(lèi)及其生物合成途徑，利于有效防治白頭翁葉斑病的發(fā)生。本研究對(duì)白頭翁葉斑病菌黑色素的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，明確了其具有一般黑色素的共同特性[14]；紅外光譜分析表明，白頭翁葉斑病菌胞壁結(jié)合黑色素和胞內(nèi)黑色素為同一類(lèi)型的黑色素，具有DHN黑色素的特征吸收峰，不同于DOPA黑色素。一些植物病原真菌，如水稻稻瘟病菌(M.grisea)、禾谷炭疽病菌(Colletotrichumgraminicola)、葫蘆刺盤(pán)孢菌(Colletotrichumlagenarium)均含有DHN黑色素[15]，且被認(rèn)為是重要的毒力因子，白頭翁葉斑病菌DHN黑色素是否與病原菌致病性相關(guān)有待進(jìn)一步研究。

三環(huán)唑在濃度為10～100 μg/mL時(shí)均能抑制白頭翁葉斑病菌黑色素產(chǎn)生，濃度僅為10 μg/mL即可使菌落顏色發(fā)生變化，說(shuō)明該病菌對(duì)三環(huán)唑十分敏感，這與玉米大斑病菌對(duì)三環(huán)唑的敏感性十分相似[5]。

本文結(jié)合白頭翁葉斑病菌的紅外光譜特征、白頭翁葉斑病菌對(duì)三環(huán)唑的敏感程度以及AaPKS基因的獲得，初步斷定白頭翁葉斑病菌黑色素合成為DHN合成途徑。今后將進(jìn)一步對(duì)AaPKS基因的功能進(jìn)行深入研究，明確該基因在白頭翁葉斑病菌黑色素合成途徑中的作用，為白頭翁葉斑病菌的致病機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

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CharacteristicsandbiosyntheticpathwayofmelanininAscochytaanemones

Su Dan1, Lü Guozhong1, Zhou Rujun2, Yang Hong1, Fu Junfan2

(1.CollegeofEnvironmentandResources,DalianNationalitiesUniversity,Dalian116600,China;2.CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China)

The characteristics of melanin, extracted from cell wall and fermented filtrate ofAscochytaanemones, were determined by diagnostic test and infrared spectroscopy. The results indicated that they have similar physical and chemical properties, and they are soluble in KOH, H2O2and NaClO, but not in water, ethanol and acetone. Infrared spectrum analysis showed that the wall-bound melanin and extracellular melanin belonged to the same type. Tricyclazole, a specific inhibitor of DHN melanin synthesis, could inhibit the fungal melanin’s biosynthesis ofA.anemones. The homologous fragment of polyketide synthase gene (AaPKS) was amplified by PCR usingA.anemonesgenomic DNA as a template. The results suggested that the melanin inA.anemonesmight be synthesized from DHN pathway.

Ascochytaanemones; melanin; infrared spectra scanning; DHN pathway

2014-04-28

：2014-08-04

S 432.1

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.005

* 通信作者 E-mail:fujunfan@163.com