吳 菲，楊涵棋，張 耀，楊 馨，周海燕，鐘振東，劉旭光

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075)

滑膜炎癥是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，滑膜細(xì)胞功能異常在炎癥中占據(jù)核心地位，并依賴(lài)于滑膜細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的炎癥信號(hào)通路進(jìn)行分子信號(hào)傳導(dǎo)。其中,NF-κB、MAPK、JAK-STAT通路是細(xì)胞內(nèi)3條重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在RA的炎癥反應(yīng)中起著極其重要的作用。前期的實(shí)驗(yàn)研究表明，艾灸對(duì)實(shí)驗(yàn)性RA家兔滑膜細(xì)胞MAPK信號(hào)通路[1]和JAK-STAT通路[2]的異常激活有明顯抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀測(cè)不同灸法對(duì)RA模型關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65、NF-κBp50、IKK表達(dá)的影響，探索不同灸法抗炎作用的NF-κB信號(hào)通路機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

日本大耳兔40只，體質(zhì)量(2.5±0.25) kg，雌雄各半，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周，分性別按體質(zhì)量分層隨機(jī)分組。福氏完全佐劑(Freund’s Complete Adjuvant，F(xiàn)CA)，美國(guó)sigma公司生產(chǎn)，購(gòu)自上海生工。艾絨為中國(guó)南陽(yáng)市東升艾絨廠(chǎng)生產(chǎn)。兔多克隆一抗試劑盒：NF-κBp50(CST，美國(guó))，NF-κBp65(博奧森，北京)，IKK(博奧森，北京)；二抗：1)生物素化山羊抗兔IgG(H+L)；2)生物素化山馬抗小鼠IgG(H+L)；三抗:辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白(HRP/A-V)；二抗三抗及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。TSJ-Q型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)；切片機(jī)(徠卡-2015，德國(guó))；Motic BA400顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威醫(yī)療儀器有限公司)；Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，Inc.)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將40只日本大耳白兔按性別、體質(zhì)量分層隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組、RA模型組、溫和灸治療組、直接灸治療組、隔姜灸治療組，每組8只。

2.2 RA造模 除對(duì)照組以外，于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第1天，參照文獻(xiàn)[3]對(duì)其余各組家兔雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)常規(guī)消毒處理后，以髕骨下緣臏韌帶外測(cè)的凹陷處為穿刺注射點(diǎn)，將福氏完全佐劑(FCA)按0.5 mL/kg體質(zhì)量平均注入雙后肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，塑造家兔佐劑性關(guān)節(jié)炎,對(duì)照組采用相同方法注入無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照。

2.3 艾灸治療 造模后第7天，將各艾灸組家兔固定于兔架上，暴露背部及膝關(guān)節(jié)(治療穴位部位剃毛約2 cm×2 cm),參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》的動(dòng)物穴位圖譜定位出“腎俞”“足三里”2穴，用艾絨自制成小艾炷(直徑4 mm，長(zhǎng)度10 mm)分別直接灸、隔姜灸(鮮姜片厚度約為1 mm)、溫和灸(距離皮膚約5 mm)家兔“腎俞”“足三里”穴各5壯，兩側(cè)交替進(jìn)行，1次/d，6 d為1個(gè)療程，共3個(gè)療程，療程之間休息1 d。對(duì)照組和模型組家兔同法固定，但不進(jìn)行艾灸治療。

2.4 標(biāo)本取樣及處理 艾灸治療后第21天，經(jīng)耳緣靜脈注射空氣處死各組家兔，沿雙后膝關(guān)節(jié)正中縱行切開(kāi)皮膚直至暴露出以膝關(guān)節(jié)為中心約3 cm×3 cm的區(qū)域，用齒鑷提起臏骨，沿臏骨上沿約0.3～0.4 cm處向下切割直至股骨，再分別沿臏骨兩側(cè)向下分離至脛骨，可見(jiàn)由臏骨下極向上延續(xù)有一層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織。完整剝離滑膜組織，最后用眼科鑷輕輕夾住其游離端，用刀片完整切下。同法采集另一側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織。組織離體后立即放入4%甲醛液中固定保存待測(cè)。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)方法 用S-P免疫組化法檢測(cè)滑膜組織的NF-κBp65、NF-κBp50、IKK含量。石蠟切片，常規(guī)脫蠟15 min；混合1份30%H2O2+10份蒸餾水后滅活內(nèi)源性酶(室溫10 min)，蒸餾水重復(fù)洗3次；抗原熱修復(fù)，自然冷卻至室溫后用PBS(PH7.2～7.6)洗滌2次；滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗；滴加NF-κBp65一抗(稀釋度1∶125)、NF-κBp50一抗(稀釋度1∶150)、IKK一抗(稀釋度1∶100)；4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗5 min×3次；滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次；滴加試劑S-V/HRP30 min(37 ℃)，PBS洗5 min×4次；顯色劑顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。用PBS液代替一抗做為陰性對(duì)照。

3 結(jié)果

不同灸法對(duì)RA模型關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65、NF-κBp50和IKK積分灰度值的影響，見(jiàn)表1。

表1 不同灸法對(duì)RA模型關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65、NF-κBp50和IKK積分灰度值的影響

注:與空白組比較，○○P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.01；與溫和灸組、直接灸組比較，★P<0.05

4 討論

RA是一種以持續(xù)性的關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征的慢性全身性自身免疫性疾病[4]。滑膜細(xì)胞在滑膜炎癥過(guò)程中始終處于核心地位，滑膜細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子絕大多數(shù)是低分子量的多肽或糖蛋白，它必須和靶細(xì)胞表面相應(yīng)的受體結(jié)合后，激活特定的信號(hào)傳導(dǎo)通路才能發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)。因此，近年來(lái)滑膜細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路及滑膜細(xì)胞的增殖信號(hào)對(duì)核內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控備受關(guān)注。已有研究表明:NF-κB在RA的滑膜細(xì)胞中廣泛表達(dá)，與其調(diào)控的細(xì)胞因子一起共同參與了關(guān)節(jié)滑膜炎癥及其損傷反應(yīng)等病理進(jìn)程，在RA的發(fā)病中起關(guān)鍵作用[5-9]。

艾灸能有效調(diào)控實(shí)驗(yàn)性RA滑膜細(xì)胞的分泌功能，抑制滑膜炎癥發(fā)展[10-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型組比較，各艾灸治療組NF-κBp65、NF-κBp50和IKK積分灰度值明顯降低(P<0.05),提示不同灸法對(duì)NF-κBp65、NF-κBp50和IKK的蛋白表達(dá)都有抑制作用，艾灸可能通過(guò)降低IKK活性對(duì)NF-κB通路進(jìn)行有效調(diào)控。 此外,還發(fā)現(xiàn)隔姜灸在抑制NF-κBp65、NF-κBp50和IKK表達(dá)方面比溫和灸、直接灸更為明顯，推測(cè)其原因可能與不同灸法具有不同的溫?zé)岽碳つＪ接嘘P(guān)，而不同溫?zé)岽碳つＪ揭餘F-κB信號(hào)通路相關(guān)分子不同表達(dá)的相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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