韓 峰，盛 莉

(解放軍第281醫(yī)院，河北 秦皇島 066100)

在軍事活動、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和日常生活中，海水淹溺事件時有發(fā)生。海水進入肺內(nèi)容易引起海水淹溺型急性肺損傷/呼吸窘迫綜合征(seawater drowning induced acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,SWD-ALI/ARDS)。肺泡是肺部氣體交換的主要部位，也是肺的功能單位。海水對肺泡上皮細(xì)胞的直接損傷以及由此導(dǎo)致的低氧血癥和酸中毒是肺損傷及呼吸窘迫綜合征發(fā)生的主要原因[1]。在正常肺組織的發(fā)育、成熟以及ALI發(fā)生、發(fā)展過程中，肺泡上皮細(xì)胞凋亡都具有重要作用。ALI時，肺泡上皮凋亡可導(dǎo)致炎癥、水腫和肺纖維化[2-3]，以及肺表面活性物質(zhì)的減少。既往實驗已證實海水可導(dǎo)致模型大鼠包括肺泡上皮細(xì)胞在內(nèi)的肺組織細(xì)胞凋亡[4]。

近年來一些研究工作已經(jīng)證實了丹參酮ⅡA[5-6]對ALI治療具有重要價值[7]。因此，本課題從觀察海水對人肺泡上皮A549細(xì)胞凋亡的影響出發(fā),進一步探討丹參酮ⅡA對海水誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的抑制作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人肺泡上皮細(xì)胞株A549由第四軍醫(yī)大學(xué)病理與病理生理學(xué)教研室惠贈。丹參酮ⅡA磺酸鈉(中國藥品生物制品檢定所，純度>98.0%)，RPMI1640培養(yǎng)基(北京賽默飛-世爾)，胎牛血清(北京元亨金馬),兔抗人FasL、Fas多克隆抗體(美國Abcam公司)，兔抗人cleaved caspase-8單克隆抗體(美國cell signal公司)，Annexin v-FITC/PI試劑盒(美國BD公司)，CK40-F200型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Kendro公司)，F(xiàn)ACS-Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素各100 u的RPMI-1640培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進行干預(yù)處理。

1.3 海水的制備 人工配方海水根據(jù)中國國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水主要成分配制[8]，無菌網(wǎng)篩過濾。按配方海水和RPMI1640培養(yǎng)基2∶3的比例(v/v)，配制成40%的海水。

1.4 實驗分組 在6孔培養(yǎng)板的每一孔中接種6×106個A549細(xì)胞,24 h后細(xì)胞貼壁進行實驗。實驗設(shè)3個組：空白對照組、海水浸泡組和丹參酮ⅡA干預(yù)組。海水浸泡組以2 mL 40%海水浸泡細(xì)胞6 h。丹參酮ⅡA干預(yù)組以2 mL 40%海水另加入丹參酮ⅡA 25 μg/mL浸泡細(xì)胞6 h。此前實驗已表明[9]，丹參酮ⅡA在25 μg/mL濃度時毒副作用最小，對海水浸泡A549細(xì)胞的保護作用最佳，故本研究選用25 μg/mL丹參酮ⅡA作為干預(yù)劑量?？瞻讓φ战M僅加入同等量的2 mL無血清培養(yǎng)基，其他處理同。每組做3平行孔，統(tǒng)計時3孔實驗數(shù)據(jù)取平均值。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 通過倒置相差顯微鏡觀察各組A549細(xì)胞形態(tài)以及活性的變化。

1.6 FITC-Annexin V/PI雙染法測定細(xì)胞凋亡率 干預(yù)完畢后，將各孔中的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，每孔再加入適量0.25%胰酶消化液，消化2～3 min后加適量含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞至完全脫落。將細(xì)胞懸液連同培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),1 000×g離心5 min，棄上清，再加入無血清培養(yǎng)基2～3 mL至離心管內(nèi)重懸細(xì)胞，然后用膜聯(lián)蛋白V-FITC及PI染色，流式細(xì)胞儀上機分析檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)分析FasL、Fas及cleaved caspase-8蛋白表達(dá) 常規(guī)消化、收集、裂解細(xì)胞，提取蛋白，考馬氏亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度,煮沸變性后12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，250 mA電流PVDF半干法轉(zhuǎn)膜30 min，10%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，然后分別加入FasL抗體(1∶100)、Fas抗體(1∶200)、cleaved caspase-8抗體(1∶200)及內(nèi)參β-actin抗體(1∶5 000)，4 ℃過夜。TBST搖床洗膜3次，10 min/次，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫下孵育2 h，TBST搖床再洗膜3次，10 min/次，最后增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色,膠片顯影和定影。將膠片進行掃描，利用凝膠圖象分析系統(tǒng)(BioSens Gel Imaging System)檢測各目標(biāo)條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 顯微鏡下觀察，對照組A549細(xì)胞胞體明亮，呈上皮型貼壁均勻生長，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，無懸浮細(xì)胞，呈圓形或多角形，核大，細(xì)胞輪廓清晰，生長狀態(tài)良好。海水浸泡組可見大量細(xì)胞脫壁懸浮，生長密度下降，細(xì)胞間接觸變松，細(xì)胞形態(tài)大小不一，圓形固縮，胞體變暗。丹參酮ⅡA干預(yù)組細(xì)胞未出現(xiàn)明顯懸浮,少數(shù)皺縮、體積變小、透光性減弱，與海水浸泡組相比，細(xì)胞生長狀況明顯改善。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果 海水作用A549細(xì)胞后較對照組細(xì)胞凋亡率顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。丹參酮ⅡA干預(yù)組細(xì)胞凋亡率與海水浸泡組相比明顯下降(P<0.01),說明丹參酮ⅡA對海水處理的A549細(xì)胞有一定的保護作用(圖1和表1)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞凋亡(B1象限為死細(xì)胞和細(xì)胞碎片,B2象限為晚期凋亡細(xì)胞，B3象限為活細(xì)胞,B4象限為早期凋亡細(xì)胞)

組 別細(xì)胞凋亡率/%空白對照組 6.1±1.4 海水浸泡組 40.0±5.3## 丹參酮ⅡA干預(yù)組20.4±2.5△△

注:與空白對照組比較，##P<0.01；與海水浸泡組比較，△△P<0.01

2.3 FasL、Fas以及cleaved caspase-8蛋白表達(dá) Western blotting結(jié)果顯示(圖2)，對照組FasL、Fas以及cleaved caspase-8蛋白僅見微量表達(dá),海水處理后這3種蛋白顯著增高,丹參酮ⅡA組FasL、Fas以及cleaved caspase-8蛋白表達(dá)量較海水浸泡組明顯下調(diào)。

圖2 Western blotting檢測A549細(xì)胞FasL、Fas及cleaved caspase-8蛋白表達(dá):1空白對照組，2海水浸泡組，3丹參酮ⅡA干預(yù)組。與空白對照組比較，**P<0.01；與海水浸泡組比較，#P<0.05，##P<0.01

3 討論

ALI肺組織的重要病理變化為肺泡上皮細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。既往認(rèn)為，ALI時肺部靶細(xì)胞死亡方式是壞死，但許多研究顯示細(xì)胞凋亡也參與了ALI/ARDS的發(fā)病過程[10-11]。

本實驗從凋亡角度探討了海水對人肺泡上皮A549細(xì)胞的影響以及丹參酮ⅡA的保護作用。通過研究發(fā)現(xiàn)，海水可以引起A549細(xì)胞凋亡，同時，丹參酮ⅡA可以有效抑制海水誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡，下調(diào)FasL、Fas及cleaved caspase-8蛋白的表達(dá)。

肺泡上皮細(xì)胞凋亡參與ALI早期病理生理過程，抑制其凋亡能夠減輕ALI[12]。肺泡上皮細(xì)胞的過度凋亡將導(dǎo)致結(jié)構(gòu)細(xì)胞數(shù)量減少和肺組織病理變化加重。海水的化學(xué)成分十分復(fù)雜，具有高鈉、高滲特性，常溫海水NaCl濃度為3%～3.5%，是正常人血液生理濃度的3倍；海水中還有碘化物、硅化物及大量的鈣(Ca)、鎂(Mg)、鋅(Zn)，錳(Mn)、銅(Cu)、鍶(Sr)等重金屬元素及化合物和天然放射性元素[1]。海水的直接和間接損傷導(dǎo)致了SWD-ALI/ARDS,而SWD-ALI/ARDS的重要發(fā)病機制則是肺泡上皮細(xì)胞在內(nèi)的肺實質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的受損。之前研究已證實海水可導(dǎo)致大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡[4],本實驗進一步觀察了海水對人肺泡上皮A549細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，海水可以顯著引發(fā)A549凋亡。

Fas是一種分子量為45-kDa的I型膜蛋白，屬于TNF受體家族，而FasL是一種分子量為37-kDa的Ⅱ型膜蛋白。Fas與FasL結(jié)合后,可迅速激活由caspase-8引發(fā)的一系列caspase級聯(lián)反應(yīng)，裂解DNA,誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Fas/FasL介導(dǎo)的死亡受體信號途徑在ALI/ARDS時肺泡上皮凋亡的調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[13]。本實驗Western blotting結(jié)果顯示，海水處理的A549細(xì)胞在出現(xiàn)凋亡的同時，F(xiàn)asL、Fas及cleaved caspase-8蛋白表達(dá)明顯增加，說明海水可以通過激活Fas/FasL信號通路介導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。加入丹參酮ⅡA后，上述3種蛋白的表達(dá)量明顯下降，證實丹參酮ⅡA能夠調(diào)控FasL、Fas及caspase-8蛋白的活化，從而有效減少A549細(xì)胞凋亡。

綜上所述,丹參酮ⅡA可通過Fas/FasL介導(dǎo)的死亡受體信號途徑抑制海水誘導(dǎo)的人肺泡上皮A549細(xì)胞凋亡，這為從肺泡上皮細(xì)胞凋亡角度深入研究SWD-ALI的發(fā)生機制和藥物治療提供了依據(jù)。但海水淹溺后，是否還有其他信號通路參與了肺泡上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)以及丹參酮ⅡA臨床治療的有效性，還有待進一步研究。

[1]韓志海,田光,段蘊鈾.海水淹溺致急性肺損傷的研究進展及展望[J].中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志,2006,13(6):378-381.

[2]GROPPER M A,WIENER KRONISH J.The epithelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome[J].Curr Opin Crit Care,2008,14(1):11-15.

[3]KUWANO K.Epithelial cell apoptosis and lung remodeling[J].Cell Mol Immunol,2007,4(6):419-429.

[4]LI J H,XU M,XIE X Y,et al.Tanshinone IIA suppresses lung injury and apoptosis,and modulates protein kinase B and extracellular signal-regulated protein kinase pathways in rats challenged with seawater exposure[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2011,38(4):269-277.

[5]周瑞芳,劉鵬熙,劉曉雁.丹參注射液對細(xì)胞基底樣乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,28(5):773-775.

[6]宋朝陽.丹參注射液對肝硬化脾亢脾切除術(shù)后血液流變學(xué)的影響[J].吉林中醫(yī)藥,2013,33(11):1127-1128.

[7]徐敏,黃亮.急性肺損傷的發(fā)病機制及丹參治療研究進展[J].中華全科醫(yī)學(xué),2008,6(9):966-967.

[8]段蘊鈾,胡慧軍,潘曉雯,等.不同氧療方式對兔海水淹溺肺水腫的治療作用[J].中國急救醫(yī)學(xué)雜志,2004,24(5):339-342.

[9]李佳歡,許敏,范啟新,等.丹參酮ⅡA磺酸鈉對海水浸泡人肺上皮A549細(xì)胞水通道蛋白5的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2011,23(1):32-35.

[10]CHOPRA M,REUBEN J S,SHARMA A C,et al.Acute lung injury:apoptosis and signaling mechanisms[J].Exp Biol Med,2009,234(4):361-371.

[11]QING LU,ELIZABETH O.Harrington,Sharon Rounds.Apoptosis and lung injury[J].Keio J Med,2005,54(4):184-189.

[12]MARTIN T R,HAGIMOTO N,NAKAMURA M,et al.Apoptosis and epithelial injury in the lungs[J].Proc Am Thorac Soc,2005,2(3):214-220.

[13]ALBERTINE K H,SOULIER M F,WANG Z,et al.Fas and fas ligand are up-regulated in pulmonary edema fluid and lung tissue of patients with acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome[J].Am J Pathol,2002,161(5):1783-1796.