李京玉,楊 博,樸芮仙,魏洪志,金明玉

(延邊大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

補(bǔ)肺元湯來源于《東醫(yī)壽世保元》，是朝醫(yī)治療太陰人血管性癡呆的有效方劑。本研究主要利用朝醫(yī)藥辨象辨證理論，觀察朝醫(yī)補(bǔ)肺元湯對血管性癡呆(vascular dementia,VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制。

1 實驗材料

補(bǔ)肺元湯(麥門冬、桔梗、五味子)購自延邊中醫(yī)醫(yī)院；Morris水迷宮及其記錄分析系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司研制);哈伯因片(河南竹林眾生制藥股份有限公司豫中制藥廠生產(chǎn))，SOD、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，乙酰膽堿脂酶活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))，臺式低溫離心機(jī)(日本SYNYO公司)；冰凍切片機(jī)(德國);HM-200型電子天平(日本)。

2 實驗方法

選用清潔級健康SD成年大鼠32只，雌雄不限，體質(zhì)量250 g左右，分籠飼養(yǎng)。由延邊大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)均分為假手術(shù)組(1組)、模型組(2組)、哈伯因組(3組)、補(bǔ)肺元湯組(30 mg/kg)(4組)。

2.1 動物模型制備 采用王蕊等[1]改進(jìn)方法制作VD模型:大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。以10%水合氯醛(350 mg/kg，靜脈注射)麻醉后，將大鼠仰臥位固定于鼠臺，頸部皮膚剪毛備皮，碘伏酒精常規(guī)消毒。切口位于頸正中線左側(cè)旁開0.5 cm處,長約1 cm。鈍性分離雙側(cè)頸總動脈(CCA)，在夾閉雙側(cè)CCA之前，腹腔注射硝普鈉注射液(2.5 mg/kg)，隨即用無創(chuàng)傷性夾閉雙側(cè)CCA10 min，放開動脈夾閉再通10 min，再夾閉10 min，再通后縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)；假手術(shù)組大鼠麻醉及手術(shù)過程與模型組相同，但不阻斷CCA，不注射硝普鈉，實驗過程保持室溫22～25 ℃，術(shù)后每只大鼠肌肉注射青霉素20 u單位，1次/d，連續(xù)3 d。

2.2 各組動物給藥 術(shù)后10 d開始灌胃給藥，補(bǔ)肺元湯劑量為30 mg/kg，3次/周，連續(xù)給藥4周；哈伯因組按0.5 mg/kg灌服，假手術(shù)組、模型組灌胃等量生理鹽水。

2.3 Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力測定 灌胃結(jié)束前5 d，開始進(jìn)行Morris水迷宮測試。試驗前一天，大鼠在水迷宮中自由游泳5 min熟悉環(huán)境。定位航行實驗：實驗歷時4 d，每天分上、下午2個時段分別測試，每只各測試2次。訓(xùn)練時將大鼠面向池壁從不同象限輕放入水中，同時記錄其在120 s內(nèi)四肢爬上平臺的時間,即上臺潛伏期。大鼠爬上平臺后讓其停留10 s。如果120 s內(nèi)大鼠未找到平臺，則將其引導(dǎo)到平臺上站立10 s,并記錄上臺潛伏期為120 s。每天第一次將大鼠從離站臺最遠(yuǎn)象限面向池壁入水，并記錄上臺潛伏期?？臻g探索實驗:實驗第5天，撤離平臺，將大鼠從離站臺最遠(yuǎn)的象限面向池壁入水，觀察記錄120 s內(nèi)其經(jīng)過原平臺位置處的次數(shù)，并記錄為穿越站臺次數(shù)。

2.4 腦組織AchE、SOD活性及MDA含量測定 實驗動物于Morris水迷宮定位探測實驗結(jié)束后，迅速斷頭取腦，用潮濕濾紙除去血液，在冰盤中分離右側(cè)大腦半球皮層和紋狀體組織，稱重。在冰浴上按1∶9(W/V)加入4 ℃勻漿介質(zhì)(生理鹽水)，高速細(xì)胞粉碎機(jī)勻漿(14 000 r/min,30 s),3 500 r/min離心10 min。取上清液加入測定管中，以考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，分裝于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按乙酰膽堿脂酶活性測定試劑盒說明操作。在紫外分光光度計412 nm波長處比色測定腦皮層和紋狀體組織AchE活性，660 nm波長處測定腦組織SOD活性，532 nm波長處測定腦組織MDA含量。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)肺元湯對VD大鼠行為學(xué)的影響 見表1。

組別上臺潛伏期/s逃避潛伏期/s總游泳路徑III/T(%)1組27.03±5.79 28.03±22.93 2.89±1.46 37.80±5.54 2組77.98±2.91##34.37±27.40 2.81±1.49 30.26±4.65##3組40.91±3.70△ 43.76±26.86 4.23±3.22 32.12±6.24 4組39.33±7.32△ 24.12±20.42△4.68±1.81△37.26±7.27△

注:與假手術(shù)組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

3.2 補(bǔ)肺元湯對VD大鼠腦組織SOD活性、MDA含量及AchE活性的影響 見表2。

組別SODMDA皮層AchE活性紋狀體AchE活性1組 92.37±3.68 7.24±0.26 5.38±1.2112.93±1.61 2組 74.57±4.71# 8.68±0.52 5.35±1.54 7.88±1.15## 3組 97.58±2.86 5.97±0.30 4.94±1.12 8.23±1.95 4組105.13±1.71△▲5.63±0.31△▲5.92±1.4711.57±2.93△△▲▲

注:與假手術(shù)組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與哈伯因組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4 討論

補(bǔ)肺元湯由麥門冬、桔梗、五味子組成[6,9-11]，屬于太陰人方劑，為補(bǔ)肺養(yǎng)胃生津，主治太陰人記憶力減退的常用方劑。太陰人在四象人當(dāng)中占一半以上，臟局特點[7]是肺小肝大，病機(jī)特點是血濁氣澀，肺虛過燥，且肺的“黨與”里包括頭腦，故太陰人患腦血管疾病和血管性癡呆的比例相對高，采用太陰人方補(bǔ)肺元湯對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及機(jī)制研究。通過Morris水迷宮定位航行實驗觀察補(bǔ)肺元湯與模型組相比較，逃避潛伏期明顯縮短，大鼠上臺潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),補(bǔ)肺元湯組可以改善大鼠空間學(xué)習(xí)能力，提高SOD的活性、降低正常MDA含量、提高模型大鼠紋狀體AchE活性,通過清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化而起到改善學(xué)習(xí)記憶和腦保護(hù)作用[3-5]。

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