羅琴琴，杜艷軍

(湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院，武漢 430061)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s diseases，AD)，即老年性癡呆，是一種進行性的神經(jīng)退行性疾病，多以近事記憶喪失為首發(fā)癥狀，逐漸出現(xiàn)記憶減退、認知功能損害、精神行為異常等癥狀，病情呈進行性加重?！?013年世界阿爾茨海默病報告》指出：2010—2050年，全球范圍內(nèi)60歲及以上的老年人群中,13%(約2.77億)的人需要長期護理，而這2.77億人中約有一半的人患有阿爾茨海默病。據(jù)報道，我國隨著老年化人口的快速增漲，阿爾茨海默病的患病人數(shù)也會越來越多，其發(fā)病率與國際水平相當。面對這一嚴峻的局勢，雖然國內(nèi)外醫(yī)學研究者對其治療方法有了深入的探索，但仍未尋求到一種可以治愈或者阻止其病情發(fā)展的治療方法。目前的研究表明：β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)在腦內(nèi)沉淀形成老年斑是AD主要的病理改變之一，而且Aβ及其興奮性神經(jīng)毒是導致神經(jīng)元損傷和死亡,患者出現(xiàn)記憶衰退的關鍵[1]。因此,減少Aβ的生成和促進其降解，是改善AD病理變化，減少Aβ的神經(jīng)毒的根本途徑。近年研究[2]表明,腦啡肽酶(NEP)是體內(nèi)重要的Aβ降解酶，它通過催化降解Aβ而調(diào)節(jié)腦內(nèi)Aβ的水平。先前有關AD的實驗研究[3]顯示,針刺提高了AD大鼠的認知能力，從癥狀上肯定了針灸對AD的療效。本研究根據(jù)補腎益髓的治則，采用傳統(tǒng)針灸療法治療AD模型大鼠，觀察該療法對大鼠海馬區(qū)NEP表達的影響,以期為針灸治療AD的臨床應用提供一定的理論基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及分組 由湖北省疾控中心供的SPF級Wistar大鼠，雄性58只,月齡為12個月左右，體質(zhì)量為(360±20)g。實驗前適應性馴養(yǎng) 1周后，所有大鼠經(jīng)Morris水迷宮測試，剔除不合格者(即反應過于遲鈍或靈敏者)。將合格的40只大鼠隨機分為4組:正常組、模型組、假手術組和治療組。正常組:常規(guī)飲水和飼料, 不給予任何處理；模型組:造模后不給予任何處理；假手術組：顱內(nèi)注射等量生理鹽水，手術方法及注藥方法同模型組；治療組：造模后,采用針刺和艾灸方法治療。整個實驗過程中,全部實驗動物均用在非鋁制品的器皿中存放相同的飼料喂養(yǎng),自由飲食, 光線適中。治療結(jié)束后, 各組大鼠在同一天內(nèi)取材。

1.2 主要實驗試劑和儀器 主要儀器：WDT-Ⅱ型微電極推進器腦立體定位儀(西安西北光電儀器廠)，AS325輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(Shandon),IB-PS包埋機(武漢俊杰電子有限公司)，TI-SR倒置熒光顯微鏡(日本尼康)，DS-U3成像系統(tǒng)(日本尼康)，WD-9405A脫色搖床(北京市六一儀器廠),BHS-313型Olympus顯微鏡(Olympus,Japan),Image-pro-plus圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics Inc,USA)。主要試劑：Aβ1-42(美國Sigma公司)，BSA(A7030,美國Sigma公司)，CY3標記山羊抗兔NEP多克隆抗體(美國jackson公司)，兔抗大鼠NEP多克隆抗體(美國Sigma公司)。

2 實驗動物

2.1 動物模型制作 大鼠稱重，用10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后，行俯臥位固定于顱腦立體定位儀上,保持前后囟在同一水平，剪開頭皮，暴露前囟，在前囟后3.3 mm，中線左右各旁開1.5 mm，用牙科鉆鉆一小孔(直徑1 mm),垂直插入微量注射器，使針尖自顱骨表面緩慢進針3.3 mm至海馬區(qū)，用微量注射器分別注入5 μL聚集肽的Aβ1-42(Aβ1-42先在50 μL二甲基亞砜溶液中混勻溶解，離心機離心后再放入50 μLPBS緩沖液中稀釋，離心機離心后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，5 min內(nèi)注射完，注射后留針5 min，按1.0 mm/min速度緩慢出針，以免拔針時藥物溢出，術后牙托粉封固顱骨孔，縫合頭皮，局部外敷青霉素G粉，術后3 d內(nèi)每天肌注青霉素80萬U以預防感染。

2.2 動物治療方法 治療組大鼠造模后，于“百會”和雙側(cè)“腎俞”[4]3個穴先進行針刺(1寸毫針)，留針15 min后，再用細艾條(自制直徑約0.6 cm)在穴位上方2～3 cm處行溫和灸，使穴位表皮溫度在(43±1)℃，持續(xù)15 min，1次/d，6 d為1個療程，療程間休息1 d，共2個療程。

2.3 動物取材 治療結(jié)束后，將各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3 mL/kg，腹腔注射)中度麻醉后，仰臥固定于鼠板上，自領下至上腹行胸腹聯(lián)合切口，切斷肋骨、膈肌，暴露出心臟，向左心室插入灌注針頭，快速灌入無菌生理鹽水500 mL沖洗組織內(nèi)血液，同時剪開右心耳，沖洗至肝臟變白，灌注時間約10 min，見大鼠尾巴、四肢僵硬視為滿意，完畢后，斷頭取腦，參照大鼠腦立體定位圖譜分離海馬，置于4%中性緩沖甲醛中，浸泡外固定24 h，取海馬標本。NEP的陽性表達采用SABC免疫組化和免疫熒光法檢測(具體按試劑說明書操作)。

3 實驗結(jié)果

2種檢驗方法中，各組分別隨機選10張切片，免疫組化切片在100倍光學顯微鏡下拍攝；免疫熒光切片在200倍的熒光顯微鏡下拍照,拍照時盡量讓組織充滿整個視野。所有照片應用Image-Pro Plus6.0軟件進行分析，得出每張照片陽性的累積光密度值(IOD值),IOD值越大，表示NEP陽性表達越強。各組的IOD值統(tǒng)計見表1。

結(jié)果表1所示，海馬CA1區(qū)NEP表達成像的積分密度值可以間接反應NEP 表達量的水平，其值越高表示NEP的含量越多，反之亦然。經(jīng)統(tǒng)計分析，筆者發(fā)現(xiàn),假手術組與正常組比較P>0.05，即2者間無統(tǒng)計學意義，2組間結(jié)果沒有明顯的差別，表明在AD模型的制作過程中，手術給實驗造成影響可以忽略。模型組與假手術組相比較，2種檢測結(jié)果分別是P<0.05和P<0.01，具有統(tǒng)計學意義，提示造模成功，且模型的成功主要是由于注射了凝聚態(tài)的Aβ1-42。模型組與治療組相比較，2個實驗結(jié)果均為P<0.01，有統(tǒng)計學意義，表明經(jīng)針灸治療后，大鼠海馬NEP顯著性增高，從而促進Aβ的降解，改善了AD的病理變化，延緩了其病理進程。根據(jù)上表中免疫組化的結(jié)果繪制了柱形圖，如圖1所示,更直觀的顯示了免疫組化中各組NEP的表達情況。

表1 2種實驗中NEP陽性表達的累積光密度值

注：與正常組相比較，#P>0.05；與假手術組相比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組相比較，▲P<0.01，▲▲P<0.01。

注：與正常組相比較，#P>0.05；與假手術組和正常組相比較，△P<0.05；與模型組相比較，△△P<0.091。圖1 各組大鼠海馬區(qū)NEP表達成像的積分密度值比較

各組免疫熒光切片在激發(fā)波長為510～560 nm拍下目的蛋白NEP的表達(紅光)。若圖中紅色光斑越亮越密集，表明NEP的表達越多。經(jīng)比較4組圖片中紅光的亮度和密度可以看出正常組和假手術組的NEP表達最多，且正常組較假手術組表達更顯著,可能存在造模中的手術創(chuàng)傷的影響，但模型組與假手術組相比，NEP的表達明顯減少，其手術創(chuàng)傷可以乎略,表明此次造模成功；經(jīng)治療后，NEP的表達較模型組增強，說明該療法可以促進NEP的表達。

4 討論

4.1 補腎益髓法 阿爾茨海默病在祖國醫(yī)學中可歸屬為心神失常、善忘、呆病、癡證等，病位在腦。雖然其病因復雜，但主要是因腎虛精虧，腦減髓消，神機失用而致，可見該病與腎和腦密切相關。中醫(yī)認為腎主骨，生髓充腦，且《靈樞經(jīng)·海論》稱：“髓海有余，則輕勁多力，自過其度；髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥?！爆F(xiàn)代科學方法也表明了腎與腦關系密切,李航等[5]指出交感神經(jīng)-腎上腺素能系統(tǒng)與腎陰陽的虛實有著明顯關系，沈自尹[6]發(fā)現(xiàn)腎虛證存在著下丘腦-垂體-靶腺(甲狀腺、腎上腺、性腺等)多軸的功能紊亂。由此可見，補益腎臟，益髓充腦是治療AD的關鍵,并且此治療原則在先前的多個相關實驗研究中[7-9]得到了肯定療效。因此，筆者選用位于腦之顛的“百會”和腎的背腧穴“腎俞”治療AD大鼠，以達到補腎益髓的作用。

4.2 NEP與阿爾茨海默病 大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細胞外β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques,SP)是AD顯著的神經(jīng)組織學病理特征之一。目前，許多研究者認為Aβ的沉積是AD病理的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)。因此，減少Aβ的產(chǎn)生、促進其降AD的防治有重要的意義。在生理條件下,Aβ在機體中的產(chǎn)生和清除處在一個動態(tài)平衡的狀態(tài)中，機體不會受到損傷性影響。但當這一動態(tài)平衡被打破,即Aβ的產(chǎn)生增多或者清除減少，則可導致Aβ的異常增多，聚集，最終在細胞外形成沉積的老年斑,引起一系列的炎癥反應，在細胞內(nèi)則產(chǎn)生神經(jīng)毒作用，均能對神經(jīng)元造成損傷。目前，體內(nèi)實驗已證明了腦啡肽酶可以裂解細胞外的Aβ，減少其對神經(jīng)元的損傷。

腦啡肽酶(NEP)是一種含有鋅離子的Ⅱ型膜蛋白，為中性內(nèi)肽酶M13家族中的一員。作為胞外酶，NEP優(yōu)先水解細胞外的寡肽(<5 kDa)，水解作用發(fā)生在疏水氨基酸殘基的氨基側(cè)，因此NEP尤其這一特適合分子量較小的，且含有40～42個疏水氨基酸的Aβ肽的降解[10]，同時NEP也可以列解內(nèi)啡肽、生長抑素、緩激肽等一些分子量小于5 kDa的神經(jīng)肽。在腦內(nèi)，表達于NEP主要表達于黑質(zhì)紋狀體通路及海馬等處神經(jīng)元的突觸前膜和突觸后膜,而這些部位正是易于形成老年斑的區(qū)域，且臨床研究也發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)易于形成老年斑的海馬和顳中回等區(qū)域NEP含量顯著下降[11]。大量實驗表明[12-13]，Aβ在腦內(nèi)的水平隨NEP的增多而減少，當NEP的基因敲除或使用NEP抑制劑時，Aβ的含量增多。由此可見，NEP對Aβ的降解中起著重要的作用，目前已廣泛認為NEP為Aβ降解的限速酶。

目前研究發(fā)現(xiàn)，多種途徑如自噬溶酶體、泛素蛋白酶體系統(tǒng)等和各種生物活性分子如腦啡肽酶、前序列蛋白酶、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶、胰島素降解酶、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、纖溶酶和基質(zhì)金屬蛋白酶-9等，共同構(gòu)成了Aβ的降解系統(tǒng)。本研究表明經(jīng)“補腎益髓”的針灸療法治療后，AD大鼠海馬區(qū)NEP的表達顯著增加，說明該治療可通過提高NEP的含量，促進 Aβ降解，減少其對神經(jīng)元的毒性損傷，延緩AD的病理進程。而NEP作為Aβ降解系統(tǒng)中的一員，由此可以推論該針灸療法可能具有上調(diào)Aβ降解系統(tǒng)功能的作用，從而全面促進Aβ的降解，因而緩解AD的病理進程。

[1]Townsend K P,Obregon D,Quadros A,et al.Proinflammatory and vasoactive effects of Abeta in the cerebrovasculature[J].Ann N Y Acad Sci,2002,977:65.

[2]Iwata N,Tsubuki S,Takaki Y,et al.Identification of the major Abeta1-42-degrading catabolic pathway in brain parenchyma:Suppression leads to biochemical and pathological depos-tion[J].Nat Med,2000,6(2):143-150.

[3]佟欣,劉丹丹,衛(wèi)彥,等.電針對阿爾茨海默病模型大鼠認知行為影響的實驗研究[J].長春中醫(yī)藥大學學報,2012,28(1):20.

[4]郭義.實驗針灸學附錄四常用實驗動物針灸穴位[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2008:360.

[5]李航,熊瞡,周全榮.腎虛證現(xiàn)代研究進展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2005,6(4):246-248.

[6]沈自尹.衰老—生理性腎虛證的HPAT軸分子網(wǎng)絡調(diào)控研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,24(9):841-843.

[7]熊萍,杜艷軍,夏微光,等.電針加艾灸對AD模型大鼠海馬細胞周期調(diào)節(jié)因子cyclinD1、p16INK4a的影響[J].湖北中醫(yī)雜志,2012,34(11):27-28.

[8]夏微光,杜艷軍,孫國杰,等.電針加灸對AD模型大鼠細胞周期調(diào)節(jié)因子cyclinE、p21/cip的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合研究,2012,12(6):306-309.

[9]錢超,姜亞軍.中西醫(yī)結(jié)合治療老年性癡呆112例臨床觀察[J].長春中醫(yī)藥大學學報,2012,28(2):307-308.

[10]Yasojima K,Mc Geer E G,Mc Geer P L.Relationship between beta amyloid peptide generating molecules and neprilysin in alzheimer disease and normal brain[J].Brain Research,2001,919(1):115-121.

[11]Wang D S,Iwata N,Hama E,et al.Oxidized neprilysin in aging and Alzheimer's disease brains[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2003,310:236-241.

[12]Iwata N,Tsubuki S,Takai Y,et al.Metabolic regulation of brain Aβby neprilysin[J].Science,2001,292(5521):1550-1552.

[13]Iwata N,Mizukami H,Shirotani K,et al.Presynaptic Localization of Neprilys in Contributes to Efficient Clearance of AmyloidB Peptide in Mouse Brain[J].The Journal of Neuroscience,2004,24(4):991-998.