羅利瓊，胡 林，馮 剛

(1.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院 腫瘤科，武漢 430064；2.武漢市普愛醫(yī)院 腫瘤科，武漢 430033)

目前，越來越多研究示低氧環(huán)境培養(yǎng)能提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖能力和遷移能力[1-3]。復(fù)方苦參注射液廣泛用于多種晚期腫瘤的治療和惡性胸腔積液治療等方面。在一定濃度藥物和不同氧濃度條件的作用下,BMSCs是否能繼續(xù)存活進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的作用顯得很重要。為此，在前期試驗的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察攜帶目的基因的BMSCs在復(fù)方苦參注射液作用下和在常氧或缺氧條件下細(xì)胞增殖和遷移能力變化情況。

1 實驗材料與方法

1.1 材料 大鼠肝癌細(xì)胞株Walker-256細(xì)胞購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心；rBMSCs為普愛醫(yī)院實驗室構(gòu)建和保存;復(fù)方苦參注射液購自購自山西振東制藥股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法 取對數(shù)生長期的rBMSCs種于96孔培養(yǎng)板,每組設(shè)12個復(fù)孔。置37 ℃常氧或低氧(5%)條件下，分別加入復(fù)方苦參注射液(濃度分別為300、200、100、50、25 μL/mL)，培養(yǎng)6、12、24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT液，37 ℃孵育4 h后吸棄培養(yǎng)液，用酶標(biāo)儀于570 nm波長下測量OD值。以不含復(fù)方苦參注射液組為陰性對照，以空白孔進(jìn)行調(diào)零。細(xì)胞存活率=(加藥組-空白組)/(對照組-空白組)×100%。

1.2.2 ELISA法 取對數(shù)生長期的Walker-256細(xì)胞種于24孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁完全后將Transwell小室放入24孔，在上室內(nèi)加入不含血清的rBMSCs。置37 ℃常氧或低氧(5%)條件下，分別在復(fù)方苦參注射液(濃度分別為300、200、100 μL/mL)培養(yǎng)12、24、48 h后，吸取Transwell小室中的培養(yǎng)液。用ELISA法對上清液中SDF-1進(jìn)行檢測。室溫顯色后用酶標(biāo)儀于450 nm處測吸光度值并制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定各樣本中含量。

1.2.3 Transwell法 取對數(shù)生長期的Walker-256細(xì)胞種于24孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁完全后將Transwell小室放入24孔，在上室內(nèi)加入不含血清的rBMSCs。置37 ℃常氧或低氧(5%)條件下，分別在復(fù)方苦參注射液(濃度分別為300、200、100 μL/mL)培養(yǎng)12、24、48 h后，取出Transwell小室。棉棒輕輕擦去濾膜頂層的細(xì)胞。各選擇5個無重疊區(qū)，于高倍鏡(×200)下計數(shù)穿過基質(zhì)膜濾膜底面的細(xì)胞數(shù)。

2 實驗結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活情況 隨復(fù)方苦參注射液濃度增加和處理時間延長，細(xì)胞存活率呈逐漸下降趨勢。25 μL/mL和50 μL/mL組在各處理時間段的細(xì)胞存活率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。100 μL/mL、200 μL/mL和300 μL/mL組在處理24、48、72 h后細(xì)胞存活率與其他組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但三者在處理后72 h的細(xì)胞存活率，與48 h組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。100 μL/mL和200 μL/mL組能提高在低氧條件下的細(xì)胞存活率，見圖1。

2.2 SDF-1變化情況 在200 μL/mL處理24 h組，上清液中SDF-1含量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在100 μL/mL和300 μL/mL組，處理12、24、48 h上清液中SDF-1，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。200 μL/mL組在低氧條件下其SDF-1含量較常氧條件下明顯減少(P<0.05)，見圖2。

2.3 細(xì)胞遷移情況 200 μL/mL組細(xì)胞遷移率與其他組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余各組間比較無差異(P>0.05)。200 μL/mL處理24 h組，與處理12 h和48 h組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。200 μL/mL組在低氧條件下處理12 h和48 h間比較有差異(P<0.05)；在常氧條件下2組間比較無差異(P>0.05)。見圖3。

圖1 對照組和實驗組細(xì)胞的存活率比較(n=12)

圖2 細(xì)胞上清液中SDF-1含量(n=6)

圖3 對照組和實驗組細(xì)胞的跨膜遷移率比較(n=6)

3 討論

BMSCs的移植可以用于治療多種肝臟疾病[4-6]，融合目的基因的BMSCs細(xì)胞移植療法可能為惡性腫瘤的治療提供一種新的治療手段[7-9]。本實驗室構(gòu)建了表達(dá)纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)重要結(jié)構(gòu)域的真核表達(dá)載體pCE-GFP質(zhì)粒，并在BMSCs中獲得高效穩(wěn)定表達(dá)，其在體外實驗中影響癌細(xì)胞的增殖等[10]。復(fù)方苦參注射液是以苦參和土茯苓等為原料經(jīng)科學(xué)提煉而制成的注射劑，其主要有效成分為苦參堿和氧化苦參堿等。研究證明，復(fù)方苦參注射液對多種腫瘤細(xì)胞有直接的殺傷作用；減弱多種腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲和運動能力，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等方面的作用[1-3,11-14]。BMSCs在體內(nèi)體外復(fù)雜條件下細(xì)胞生物學(xué)行為的變化情況目前是不清楚的。為此，在前期試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究BMSCs在復(fù)方苦參注射液作用下的細(xì)胞增殖和遷移能力的變化情況。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨復(fù)方苦參注射液濃度增加和處理時間延長，rBMSCs細(xì)胞存活率呈逐漸下降趨勢。但在100 μL/mL、200 μL/mL和300 μL/mL組處理24 h和48 h后細(xì)胞存活率，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；處理72 h和48 h后3組細(xì)胞的存活率無明顯差異。進(jìn)而得出，在低氧條件下，在100 μL/mL和200 μL/mL復(fù)方苦參注射液作用下，能提高rBMSCs在較復(fù)雜條件下的細(xì)胞存活率。在200 μL/mL處理24 h組，SDF-1含量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；200 μL/mL組在低氧條件下其SDF-1含量較常氧條件下明顯減少(P<0.05)。rBMSCs分泌的SDF-1濃度，在復(fù)方苦參注射液作用下和在常氧或缺氧條件下，并未呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系和時效關(guān)系。只有在適當(dāng)濃度復(fù)方苦參注射液作用下，rBMSCs才可能分泌SDF-1。200 μL/mL組細(xì)胞遷移率與其他劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；200 μL/mL處理24 h組，與12 h和48 h組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。200 μL/mL組在低氧條件下12 h組與48 h組能增強細(xì)胞的遷移能力。分析可能原因，SDF-1含量在增強rBMSCs細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞遷移能力方面發(fā)揮一定的作用，但不是唯一的因素。短時間的缺氧條件利于rBMSCs發(fā)生遷移，長時間的缺氧條件則不利于rBMSCs發(fā)生遷移。

綜上所述，在適當(dāng)濃度復(fù)方苦參注射液作用下，在低氧條件下能提高rBMSCs在復(fù)雜條件下的細(xì)胞存活率；能促進(jìn)rBMSCs分泌SDF-1；短時間的缺氧條件利于rBMSCs發(fā)生遷移。rBMSCs在體內(nèi)體外環(huán)境中各種化療藥物作用下，其細(xì)胞增殖和遷移能力等生物特性的變化值得進(jìn)一步研究。

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