潘 日玄,陳嬋娟,魯衛(wèi)星*,趙明鏡

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,北京100007;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100007)

心肌組織是高度依賴于有氧氧化供應(yīng)能量的組織。當(dāng)供給心肌的血流量減少或心肌對氧的需求量超過其動脈最大供血量時即造成心肌缺血。缺血性損傷是指因心肌缺血引起心肌代謝、功能和結(jié)構(gòu)的改變。盡早恢復(fù)組織的血液灌流是減輕心肌缺血性損傷的根本措施。近年來，隨著溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)、動脈搭橋、心臟外科體外循環(huán)等方法的建立和推廣，使缺血心肌更快地重新獲得血液供應(yīng)，明顯減少了由于缺血導(dǎo)致的細(xì)胞壞死，提高了臨床療效，減少了病死率。但是，在臨床觀察和動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，缺血組織細(xì)胞恢復(fù)灌流后，部分患者或動物的心肌損傷反而加重，因而將這種血液再灌注使缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象稱之為缺血-再灌注損傷(Ischemia-Reperfusion Injury)，簡稱再灌注損傷(Reperfusion Injury)[1]。除心肌組織外，再灌注損傷也同樣危害著腦及其他器官組織[2]。對于急性心肌梗死或心臟外科手術(shù)的患者來說，其心肌的損傷包括2個階段:1)缺血引起的損傷；2)含氧血流恢復(fù)后的再灌注損傷，這2個階段既相互聯(lián)系，又各有特點(diǎn)。在缺血性損傷的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的再灌注損傷，涉及多種發(fā)病機(jī)制并影響缺血性疾病的預(yù)后。再灌注可以使可逆性缺血損傷加重，亦可能促進(jìn)可逆性缺血損傷轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷。在缺血性疾病防治中做到既保證盡早恢復(fù)缺血組織的血流，又減輕或防止再灌注損傷的發(fā)生，成為亟待解決的重要課題[1]。故正確而有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽鋵μ剿魅毖?再灌注損傷的機(jī)制尤為重要。離體心臟模型是指將動物心臟取出胸腔，連接于特定的灌流裝置，灌注液灌注其冠脈系統(tǒng),使離體心臟在人工控制的條件下自主搏動。離體心臟模型是心肌缺血-再灌注損傷機(jī)制研究和心血管藥物篩選的常用工具[3]。自從Langendorff[4]首次報道使用哺乳動物離體心臟進(jìn)行心臟機(jī)械功能研究以來，使研究者們可以在不受神經(jīng)體液干擾的情況下進(jìn)行心肌組織研究,在此模型基礎(chǔ)上的各種改良的Langendorff模型相繼出現(xiàn)在各種動物實(shí)驗(yàn)中。大鼠以其冠狀動脈側(cè)支循環(huán)少，心肌壞死出現(xiàn)早，心律失常發(fā)生率高，重復(fù)性與穩(wěn)定性好，費(fèi)用低廉而成為制作心肌缺血再灌注損傷的首選模型[5]。由于大鼠離體心臟冠脈在心肌內(nèi)走行不易辨認(rèn)，冠脈結(jié)扎手術(shù)操作難度大，心肌組織易損傷等特點(diǎn)，以往的離體心臟缺血再灌注模型制備多采用全心停灌后再灌的方法，但此方法與臨床中人體心臟局部缺血的實(shí)際情況有所差別,本實(shí)驗(yàn)使用12只Wistar大鼠建立Langendorff離體心臟局部缺血再灌注模型，通過結(jié)扎離體心臟前降支而造成心肌局部缺血30 min后復(fù)灌的方法，以更好的模擬實(shí)際臨床中患者心肌缺血的情況，在實(shí)驗(yàn)過程中探索并總結(jié)了成功制備模型的要點(diǎn)和經(jīng)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康Wisrar雄性大鼠12只(由北京華阜康生物科技股份有限公司提供)，體質(zhì)量300～350 g[許可證號：SCXK(京)2009-0007]。動物飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級。本研究遵循國家實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例及國家實(shí)驗(yàn)動物管理實(shí)施細(xì)則。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 Langendorff(澳大利亞ADInstruments Pty Ltd實(shí)驗(yàn)室，ML870 B2 Langendorff System)，恒溫水浴(LETIC公司，LE13206)，電子天平(上海精科天平廠,JA1003)，pH儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司，PHS-3B)，蠕動泵(GILSON公司，minipuls3)，多導(dǎo)生理儀(美國Biopac MP150)，醫(yī)用二元?dú)?95%O2+5%CO2)，帶線縫合針(上海醫(yī)用縫合針廠有限公司，規(guī)格圓3/8 2.5×8 5/0)，自制心室內(nèi)壓球囊及導(dǎo)管。

1.2.1 心室內(nèi)壓球囊測壓管制備方法 持直徑約2 mm的塑料導(dǎo)管一端輕輕抵住球囊底部,通過導(dǎo)管向球囊注入少量水的同時將導(dǎo)管緩慢拔出，僅留少許在球囊內(nèi)，0號或1號絲線扎緊，檢查球囊與導(dǎo)管結(jié)扎已緊且球囊無破口漏氣。球囊直徑約2～3 mm,直徑過小易使球囊張力增大，測量數(shù)據(jù)不夠敏感，過大則不易使球囊插入左心室。

1.2.2 主要溶液及試劑配制 K-H緩沖液的配制：儲備液的配置，在2 L燒杯中，加入雙重蒸餾水(總體積80%左右)，再依次加入氯化鈉69 g，氯化鉀3.5 g，碳酸氫鈉21 g，磷酸二氫鉀1.63 g，硫酸鎂1.44 g，充分?jǐn)嚢韬?，加入雙重蒸餾水定容至2 L，常溫保存。工作液的配置：取儲備液400 mL，加入葡萄糖3.996 g，氯化鈣0.277 5 g，充分?jǐn)嚢杈鶆颍与p重蒸餾水稀釋至2 L，再將溶液pH值調(diào)試至7.2～7.3。將過濾好的工作液分裝入Langendorff灌流容器內(nèi)。注意：凡溶液中有碳酸氫鈉或氯化鈣，則均應(yīng)分別溶解，否則易產(chǎn)生沉淀；葡萄糖、氯化鈣應(yīng)在臨用前加入以防變質(zhì)；K-H液應(yīng)當(dāng)天使用當(dāng)天配制，放置時間過久可致pH值變化[6]。

2 實(shí)驗(yàn)方法

圖1 進(jìn)針位點(diǎn)

圖2 Langendorff灌流系統(tǒng)示意圖

2.1 造模方法 大鼠稱重后，提前30 min腹腔注射肝素抗凝(1 mL/300 g)，使其充分肝素化，之后用2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射,待大鼠充分麻醉后將大鼠仰臥固定在鼠板上。首先從劍突下約1 cm處起至頸部縱向剪開胸腹部皮膚，繼而將劍突下方的肌層縱向剪至橫膈處，沿橫膈橫向剪開，同時用眼科鑷提起劍突以觀察心臟位置，防止傷及心臟；剪開橫膈后，沿兩側(cè)肋骨向上剪至頸部，將胸壁向頭部掀起，暴露出心臟。眼科鑷輕輕分離開胸腺，以鑷子夾住主動脈的根部(即主動脈與頭臂干交接處)，迅速切斷主動脈處的血管連接，以眼科鑷夾閉主動脈切斷處將心臟提出胸腔，同時使用眼科剪分離與心臟連著的肺及周圍的脂肪及結(jié)締組織，迅速將分離出的心臟放入0 ℃K-H液使之停跳,并迅速移至Langendorff儀器前，用2眼科鑷輕提起主動脈血管壁，經(jīng)儀器灌注口插入，動脈夾固定，后用棉線打結(jié)固定灌注口與主動脈相連處，灌注口應(yīng)置于主動脈瓣及冠狀動脈開口上方，K-H液經(jīng)主動脈恒流灌注(灌注壓維持在75～80 mmHg之間)。整個灌注期間溫度保持在37 ℃，為了保證離體心臟的表面有一定的溫度和濕度，將心臟置于由玻璃或有機(jī)玻璃制成的雙層保溫灌流槽內(nèi)。雙層保溫灌流槽的底部有漏斗形的開口，上方蓋子蓋住可以保持槽內(nèi)溫度恒定，灌注液經(jīng)95%O2+5%CO2鼓泡式氧合。剪開右心耳，使冠狀動脈回流液得以充分引流。待心臟經(jīng)灌流可正常搏動5 min后，使用帶線縫合針穿線，穿刺點(diǎn)位于左心耳下方約2 mm(見圖1)，隱約能看到走行于心臟表面靜脈，進(jìn)針角度應(yīng)垂直于心臟，由于前降支在心肌內(nèi)走形并非垂直，而是略向上彎曲，故盡量斜向上方出針。穿針后暫不結(jié)扎，將連有壓力傳感器的抽癟的球囊從左心耳上方與主動脈之間，經(jīng)左房與二尖瓣送入左心室，壓力傳感器與多導(dǎo)生理儀系統(tǒng)連接(見圖2),向心室球囊內(nèi)緩慢注入適量水，使心室舒張末壓維持在10 mmHg，待離體大鼠心臟收縮舒張功能逐漸穩(wěn)定后，開始記錄血流動力學(xué)，調(diào)節(jié)固定保溫灌流槽，使保溫灌流槽罩住心臟。灌流液進(jìn)入冠脈后到右心房經(jīng)腔靜脈及肺動脈滴入雙層灌流槽中，經(jīng)槽底部的漏斗形開口流出，用量筒收集一定時間內(nèi)的流出液即為冠脈流量。

平衡灌注15～20 min后觀察心臟搏動情況，以穩(wěn)定后缺血前心率在220～290次/min，左心室內(nèi)壓力約45～65 mmHg之間，心室發(fā)展壓在10.64～15.96 kPa為入選標(biāo)準(zhǔn),超出此范圍應(yīng)棄之[7]。繼而進(jìn)行前降支結(jié)扎，有文獻(xiàn)記述采用推管法[8]，但經(jīng)本課題組成員反復(fù)探索,采用橡皮筋墊放結(jié)扎更為簡便易行。將一段長約0.7 cm的橡皮筋墊放于結(jié)扎處，用之前已穿好的帶線縫合針系緊橡皮筋后打結(jié)。此方法可有效阻斷前降支血流，且不會出現(xiàn)結(jié)扎線將心肌拉斷的現(xiàn)象，有利于復(fù)灌時操作。待前降支血流被阻斷時計時30 min，缺血30 min后將橡皮筋抽出，同時可剪斷結(jié)扎線，進(jìn)行復(fù)灌75 min。

2.2 注意要點(diǎn) 1)在胸腔內(nèi)分離出心臟時，應(yīng)盡量減少器械及手與心臟觸碰，否則會影響心臟搏動。2)從體內(nèi)取出心臟后放入0 ℃K-H液中以減少心臟在離體后與再灌前的心肌耗氧量，0 ℃K-H液中需加入少量肝素，防止離體心臟冠脈凝血，且心臟應(yīng)全部浸入K-H液中，以防引起冠脈空氣栓塞。3)心臟與Langendorff連接前應(yīng)事先打開灌流儀,使灌流液從灌注口流出，以排盡管道中的空氣與雜質(zhì)防止血管栓塞。4)主動脈根部需保留0.5～1 cm長度以備插管用，灌注口應(yīng)置于主動脈瓣及冠狀動脈開口上方，若過深會損傷主動脈瓣，使灌流液流入心室腔,造成冠狀動脈灌流不充分。5)從開胸至心臟迅速轉(zhuǎn)移并固定于Langendorff離體心臟灌流裝置上，其用時一般在70 s左右[6]。6)由于心臟對溫度極其敏感，要注意K-H液從37 ℃恒溫水浴流出后在通道里所丟失的溫度，室溫不能過低。如果在灌注口處無保溫層，則可以將水浴溫度適當(dāng)調(diào)高。7)注意灌注液鼓泡式氧合時起泡不能過大，否則會損傷鈣離子[8]。8)由于本實(shí)驗(yàn)所造模型為前壁局部缺血再灌注,故結(jié)扎時需避開第一對角支，注意結(jié)扎位點(diǎn)與左主干距離，若靠近冠脈左主干過近,易出現(xiàn)室顫[9]。9)插入心室內(nèi)壓球囊測壓管后，需進(jìn)行壓力感受器調(diào)零。10)由于本實(shí)驗(yàn)采用恒流灌注,灌流量控制在10 mL/min[10]。11)按照穿線后放入球囊，再行結(jié)扎前降支的順序是防止進(jìn)針過深扎破球囊。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察缺血后再灌注心肌模型的梗死面積:實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取下心臟，將心臟橫向切成1～2 mm厚的薄片，浸于1%TTC溶液中，37 ℃橫溫水浴約15 min，梗死區(qū)為灰白色，非梗死區(qū)為磚紅色，后放入4%多聚甲醛固定。數(shù)碼相機(jī)拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件計算 IS(%)，計算方法為IS%=(梗死面積/截面總面積)×100%。本實(shí)驗(yàn)造模成功率為83%(10/12)，其中麻醉致死1只，因分離心臟時間過長致灌流后不能復(fù)跳1只。IS%為(40±6)%。圖3中所示梗死區(qū)主要位于室間隔、左室前壁及側(cè)壁大部分(見圖3)。

圖3 缺血后心肌梗死照片

4 討論

4.1 關(guān)于恒流灌注與恒壓灌注 文獻(xiàn)中所述Langendorff離體灌流多是恒壓灌流系統(tǒng)[11],然而應(yīng)用Langendorff恒流灌注系統(tǒng)也不失為另一種儀器設(shè)備的選擇。二者各有其特點(diǎn)：恒壓法便宜又方便，保持恒定液體靜力壓力即可，具體說就是保持恒定高度的液體，比如放一個儲液器并保持其灌注液與目標(biāo)主動脈灌注套管之間的距離,一般灌注壓在75 mmHg左右[12]。恒壓灌注適用于依賴心臟冠脈張力的自調(diào)節(jié)機(jī)制，尤其在灌注床各部分有連接的時候，這種情況在區(qū)域心肌缺血中出現(xiàn)，此時恒流灌注系統(tǒng)控制的單位體積心肌的冠脈灌注液遠(yuǎn)多于冠脈所需，但風(fēng)險在于可能由于剪切壓而造成冠狀動脈損害；恒流灌注多見于研究血管功能、平滑肌和內(nèi)皮功能時應(yīng)用蠕動泵控制冠脈流量。恒流灌注時如需測量灌注壓，只需在液體通路中灌注套管之前安裝一個壓力傳感器即可。已知流速，便可計算冠狀動脈阻力，如此一來便可在整個心臟的處理過程中研究血管活性物質(zhì)[8]。

4.2 缺血時間與灌注總時間的把握 根據(jù)郭麗麗等[7]的文獻(xiàn)報道,離體心臟正常灌流20～30 min各項(xiàng)指標(biāo)趨于穩(wěn)定，正常灌流70 min,各項(xiàng)指標(biāo)保持穩(wěn)定。因Langendorff離體模型中一些重要營養(yǎng)成分的不足及神經(jīng)體液環(huán)境的缺乏，離體心臟長時間灌流可能出現(xiàn)缺氧、水腫、僵硬等現(xiàn)象，因此將再灌注時間繼續(xù)延長>180 min研究意義可能不大。相反，在心肌梗死面積充分形成的前提下，盡量縮短再灌注時間則能使離體心臟心功能維持在較好狀態(tài)[13]。根據(jù)文獻(xiàn)報道，冠脈阻斷20 min以內(nèi)，缺血的心臟功能尚可恢復(fù)正常，超過20 min則導(dǎo)致心肌不可逆性壞死，因此適宜的缺血時間是導(dǎo)致心肌損傷的基礎(chǔ)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)組成員經(jīng)反復(fù)摸索將缺血時間定為30 min，再灌注75 min，既能保證再灌注損傷又能保證心肌缺血模型的造模成功率。

4.3 Langendorff離體心臟灌流原理 離體心臟灌注模型是通過主動脈逆行插管灌注灌流液。與在體心臟工作原理不同的是，隨著灌流液順著主動脈流向心肌時，主動脈瓣在壓力下呈關(guān)閉狀態(tài)，灌流液通過左右冠狀動脈開口進(jìn)入冠狀動脈系統(tǒng)營養(yǎng)心肌后，少量進(jìn)入心室內(nèi)，大多數(shù)匯集到冠狀竇，最后經(jīng)右心室和肺動脈排出，故要確保灌流液充分循環(huán)，則要確保循環(huán)后的灌流液充分排出，在結(jié)扎時切忌結(jié)扎肺動脈；也可以將右心耳剪開以更方便灌流液排出[16-17]。

[1]吳立玲,張幼怡.心血管病理生理學(xué)[M].2版.北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2009:8.

[2]白黎明,張曉雙,白璐,等.薯蕷皂苷與冰片配伍對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].吉林中醫(yī)藥,2012,32(4):75-76,79.

[3]Selye H.Simple techniques for surgical occlusion of coronary vessels in the rat [J].Angiology,1960(11):398.

[4]Porter W T.A new method for the study of the isolated mammalian heart [J].Physiol,1898(1):511-517.

[5]崔新明,曹霞,谷欣權(quán),等.在體大鼠心肌缺血時間對再灌注損傷形成的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(3):28-30.

[6]黃健,周云,楊紹軍,等.成功制作離體心臟灌注模型要點(diǎn)和經(jīng)驗(yàn)[J].實(shí)驗(yàn)動物學(xué),2011,28(4):64-66,69.

[7]郭麗麗,王階,陳雯.離體心臟缺血再灌時間與損傷模型的合理評價[C]//2011年中華中醫(yī)藥學(xué)會心病分會學(xué)術(shù)年會暨北京中醫(yī)藥學(xué)會心血管病專業(yè)委員會年會論文集.北京:中華中醫(yī)藥學(xué)會心病分會、北京中醫(yī)藥學(xué)會心血管病專業(yè)委員會,2011:5.

[8]Bell R M,Mocanu M M,Yellon D M,et al．Retrograde heartperfu-sion:The Langendorff technique of isolated heart perfusion[J].JMol Cell Cardiol,2011,50(6):940-950.

[9]李明,魯衛(wèi)星,崔現(xiàn)軍,等.提高大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型成功率的方法探討[J].遼寧中醫(yī)雜志,2010,37(9):71-72.

[10]鄭君.瑞芬太尼后處理對兔離體缺血再灌注心肌保護(hù)作用及其機(jī)制[D].云南:昆明醫(yī)學(xué)院,2010.

[11]戴小燕,方秋娟.Langendorff離體心臟灌注模型的制備及應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(13):82-85.

[12]王國印,劉宇,顧仁樾.三七有效組分對離體大鼠心肌缺血再灌注的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,16(13):21-22.

[13]黎慶捷,文偉明,鐘國強(qiáng),等.離體大鼠心臟再灌注損傷模型中最佳再灌注時間的探討[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(8):44-46.

[14]殷仁富,陳金明.心臟能量學(xué)一代謝與治療[M].上海:第二軍醫(yī)大學(xué)出版社,2002:74-76.

[15]鄧漢武.大鼠心肌缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)法[J].中國藥理學(xué)通報,1989(5):63-66.

[16]Sutherland F J,Hearse D J.The isolated blood and perfusion fluid perfused heart[J].Pharmacol Res,2000,41(6): 613-627.

[17]Süzer O,Süzer A,Ayka Z,et al.Direct Cardiac Effects in Isolated Perfused Rat Hearts Measured at Increasing Concentrations of Morphine,Alfentanil,Fentanyl,Ketamine,Etomidate,Thiopentone,Midazolam and Propofol[J].European Journal of Anaesthesiology,1998,15(4):480-485.