宋昌玲,唐啟盛,趙瑞珍,王雯龍,朱明瑾

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

焦慮癥是一類以恐懼、擔(dān)憂、緊張不安等焦慮情緒為核心癥狀的神經(jīng)癥，主要包括急性發(fā)作的驚恐障礙(Panic disorder，簡(jiǎn)稱PD)和慢性病程的廣泛性焦慮障礙(generalized anxiety disorder,簡(jiǎn)稱GAD)[1]。隨著現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的加快，GAD的發(fā)病日趨普遍。其慢性病程、易復(fù)發(fā)、影響生活質(zhì)量等特點(diǎn)，對(duì)人類身心健康的危害較大,因而對(duì)GAD的發(fā)病機(jī)制、防治措施開展深入研究極具必要性和緊迫性。本研究用環(huán)境相關(guān)恐懼應(yīng)激方法建立廣泛性焦慮大鼠模型，并通過對(duì)大鼠行為學(xué)變化的觀察、測(cè)評(píng)，對(duì)中藥疏肝清熱健脾法的干預(yù)作用進(jìn)行探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

健康Wistar雄性大鼠48只，SPF級(jí)，10周齡，體質(zhì)量(200±10) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào):SCXK(京)2010-0001。動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由攝食飲水，光照節(jié)律12L/12D(6:00～18:00)，室溫(20±2) ℃，相對(duì)濕度50%～60%，保持安靜。高架十字迷宮(開放臂50 cm×10 cm，閉合臂50 cm×10 cm×40 cm，中央?yún)^(qū)10 cm×10 cm)由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號(hào)為:XR-XG201。Xmaze實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)，由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，與高架十字迷宮設(shè)備配套。聲電刺激儀,由上海軟隆科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。丹梔逍遙散(柴胡15 g，梔子10 g，牡丹皮10 g，炒白術(shù)15 g等)購(gòu)于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，造模前按大鼠用量10.5 g/(kg·d)，灌胃劑量每次2 mL煎煮，煎取后濃縮至生藥濃度1.05 g/mL，貯存于4 ℃冰箱冷藏備用，灌胃前以溫水隔水加熱。鹽酸丁螺環(huán)酮(商品名:一舒，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H19991024)，按成人用量20 mg/(70 kg·d)的7倍、灌胃劑量每次2 mL計(jì)算大鼠用量2.0 mg/(kg·d)，以濃度0.20 mg/mL溶于蒸餾水中，灌胃前混勻。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥 動(dòng)物預(yù)養(yǎng)1周后，首先將48只動(dòng)物進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn),以水平運(yùn)動(dòng)總格數(shù)與直立次數(shù)(垂直運(yùn)動(dòng))之和為參考，按正態(tài)分布去掉置信區(qū)間95%以外的大鼠8只，剩余40只大鼠按水平運(yùn)動(dòng)與垂直運(yùn)動(dòng)之和隨機(jī)分為正常組、模型組、對(duì)照組、治療組，每組10只。自造模第1天起,正常組不予任何處理，自由攝食、飲水，模型組予以蒸餾水灌胃，對(duì)照組予以丁螺環(huán)酮水溶液灌胃，治療組予以中藥丹梔逍遙散濃縮藥汁灌胃，連續(xù)21 d。

2.2 模型制備 動(dòng)物預(yù)養(yǎng)及分組結(jié)束后，模型組、對(duì)照組、治療組與灌胃同步進(jìn)行環(huán)境相關(guān)恐懼模型的制備。本模型制備分3個(gè)階段進(jìn)行應(yīng)激，第1階段為條件性訓(xùn)練(1 d)，給予大鼠條件性刺激，程序?yàn)椤盁o(wú)刺激180 s→聲音信號(hào)30 s→足底電擊2 s→無(wú)刺激20 s”，訓(xùn)練10次；第2階段為環(huán)境相關(guān)(2 d)，將大鼠放入第一階段環(huán)境中，評(píng)價(jià)環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼程度，程序?yàn)椤盁o(wú)刺激180 s”；第3階段為改變的環(huán)境信息(2 d)，改變環(huán)境信息后觀察大鼠的條件性恐懼程度，程序?yàn)椤盁o(wú)刺激180 s→聲音信號(hào)180 s→無(wú)刺激6 s”。以上流程循環(huán)4次，共20 d。聲電刺激儀設(shè)定電流為1.2 mA，聲音信號(hào)采用“滴滴”樣相同頻率聲音。模型制備同時(shí)，觀察并記錄大鼠僵滯時(shí)間,僵滯時(shí)間記錄由3名觀察者觀察結(jié)果平均而得。模型制備期間，3組大鼠的應(yīng)激操作于每天8:00～11:30進(jìn)行，應(yīng)激前大鼠提前30 min進(jìn)入應(yīng)激實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境，操作時(shí)抓取動(dòng)物輕柔。

2.3 高架十字迷宮測(cè)試 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室保持安靜通風(fēng)，恒溫22 ℃,濕度50%～60%，室內(nèi)暗光，光線自天花板反射到高架十字迷宮測(cè)試區(qū)。迷宮由兩個(gè)開放臂(50 cm×10 cm)、兩個(gè)封閉臂(50 cm×10 cm×40 cm)、一個(gè)連接四臂的中央平臺(tái)(10 cm×10 cm)組成,開放臂與封閉臂互相垂直成十字形。測(cè)試前動(dòng)物提前60 min進(jìn)入房間適應(yīng)環(huán)境，測(cè)試時(shí)實(shí)驗(yàn)人員輕柔抓取大鼠并迅速輕放入EPM中央平臺(tái)處，放置時(shí)使大鼠頭部正對(duì)其中一個(gè)開放臂,每只大鼠測(cè)試時(shí)間5 min，各組交叉進(jìn)行，測(cè)試時(shí)攝像視頻系統(tǒng)記錄大鼠行為表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)人員可通過顯示器觀察大鼠迷宮上的活動(dòng)，每只大鼠測(cè)試結(jié)束后將排泄物清除干凈，并以酒精擦拭迷宮底部，以免影響下只大鼠行為表現(xiàn)。高架十字迷宮測(cè)試于造模結(jié)束次日15:00～18:00進(jìn)行，所有大鼠測(cè)試結(jié)束后，統(tǒng)一分析視頻，記錄并整理大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)、進(jìn)入開放臂時(shí)間、進(jìn)入封閉臂次數(shù)、進(jìn)入封閉臂時(shí)間、探頭次數(shù)、直立次數(shù)、修飾次數(shù)、排便次數(shù),并計(jì)算進(jìn)入開放臂與封閉臂次數(shù)之和、開放臂次數(shù)占總次數(shù)百分比、開放臂時(shí)間占總時(shí)間百分比。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 造模期間恐懼消退觀察 模型制備過程中，模型組、對(duì)照組、治療組在每個(gè)流程中均表現(xiàn)出電擊刺激撤除后的恐懼消退,模型組、對(duì)照組、治療組僵滯時(shí)間占總時(shí)間百分比第2，7，12，17天組間比較無(wú)差異;對(duì)照組僵滯時(shí)間占總時(shí)間百分比第4，5，8，9，10，13，14，15，18，19，20天比模型組減少(P<0.05，P<0.01)，治療組僵滯時(shí)間占總時(shí)間百分比第8，9，10，13，14，15，18，19，20天比模型組減少(P<0.05，P<0.01)；治療組僵滯時(shí)間占總時(shí)間百分比與對(duì)照組比較，第2，3，4，7，12，15，17，18，19，20天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,第5，8，9，10，13，14天治療組高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)。對(duì)照組從第1個(gè)流程開始(第4天起)表現(xiàn)出僵滯時(shí)間較模型組有差異,治療組從第2個(gè)流程開始(第8天起)僵滯時(shí)間較模型組有差異。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠恐懼消退折線圖

圖2 環(huán)境相關(guān)恐懼模型大鼠體質(zhì)量變化折線圖

模型組、對(duì)照組、治療組組內(nèi)僵滯時(shí)間占總時(shí)間百分比流程間的比較顯示：第2，7，12，17天(即每個(gè)流程第2天)、第3，8，13，18天(即每個(gè)流程第3天)、第4，9，14,19天(即每個(gè)流程第4天)及第5，10，15，20天(即每個(gè)流程第5天)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2 造模結(jié)束后一般情況及體質(zhì)量變化觀察 造模結(jié)束后肉眼觀察4組大鼠神態(tài)、毛發(fā)、飲食、糞便性狀，結(jié)果見模型組、對(duì)照組、治療組大鼠較正常組大鼠神態(tài)懶倦，毛發(fā)無(wú)光澤，飲食欠積極，活動(dòng)欠活躍，易激惹，少數(shù)大鼠見溏便。且3組大鼠與正常組大鼠對(duì)比之差別以模型組尤甚，對(duì)照組及治療組次之。造模第1，2，3天4組大鼠體質(zhì)量無(wú)差異，自第4天起至造模結(jié)束，正常組與模型組、對(duì)照組、治療組比較有差異(P<0.05，P<0.01)，其中自第8天起差異明顯，正常組高于其余3組(P<0.01)。對(duì)照組與模型組第9天起至造模結(jié)束有差異，對(duì)照組高于模型組(P<0.05,P<0.01)，治療組與模型組第7天起至造模結(jié)束有明顯差異,治療組高于模型組(P<0.01)。治療組與對(duì)照組比較第9天起至造模結(jié)束有差異，治療組高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，且第13天起至造模結(jié)束有明顯差異(P<0.01)。結(jié)果見圖2。

3.3 高架十字迷宮測(cè)試 與正常組比較，模型組、對(duì)照組、治療組開閉臂活動(dòng)總次數(shù)、開臂活動(dòng)次數(shù)所占比例、開臂活動(dòng)時(shí)間所占比例均減少(P<0.05，P<0.01)。對(duì)照組開閉臂活動(dòng)總次數(shù)、開臂活動(dòng)次數(shù)所占比例、開臂活動(dòng)時(shí)間所占比例比模型組增多(P<0.05，P<0.01)。治療組開閉臂活動(dòng)總次數(shù)、開臂活動(dòng)次數(shù)所占比例、開臂活動(dòng)時(shí)間所占比例比模型組明顯增多(P<0.01)。治療組開閉臂活動(dòng)總次數(shù)、開臂活動(dòng)次數(shù)所占比例、開臂活動(dòng)時(shí)間所占比例與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表1。

組 別開、閉臂活動(dòng)總次數(shù)開臂活動(dòng)次數(shù)所占比例/%開臂活動(dòng)時(shí)間所占比例/%正常組11.00±1.48 0.36±0.03 0.23±0.01 模型組 7.10±0.83## 0.27±0.03## 0.16±0.01## 對(duì)照組 8.90±1.64#△△0.30±0.03##△0.20±0.01##△△治療組 9.20±1.66#△△0.33±0.04#△△0.21±0.01##△△

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

與正常組比較，模型組、對(duì)照組、治療組探頭、直立次數(shù)均減少(P<0.05，P<0.01)，修飾、排便次數(shù)比正常組增多(P<0.05，P<0.01)；對(duì)照組探頭、直立次數(shù)比模型組增多(P<0.05，P<0.01)，修飾、排便次數(shù)比模型組減少(P<0.05)；治療組探頭、直立次數(shù)比模型組明顯增多(P<0.01),修飾、排便次數(shù)比模型組減少(P<0.05)；治療組探頭、直立、修飾、排便次數(shù)均與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

組 別探頭次數(shù)直立次數(shù)修飾次數(shù)排便次數(shù)正常組12.30±1.55 12.40±1.43 4.30±1.00 1.10±0.70 模型組 6.80±1.47## 8.70±1.42## 6.90±1.14## 2.70±0.78##西藥組 9.20±0.98##△△10.30±1.35##△5.70±0.90##△1.90±0.70#△中藥組 9.60±1.20##△△10.60±1.28#△△5.50±0.92#△ 1.80±0.60#△

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

4 討論

環(huán)境相關(guān)恐懼模型因刺激信號(hào)非明確及刺激不可預(yù)知被認(rèn)為可以較好地模擬彌散而持續(xù)的焦慮狀態(tài)，適合作為GAD的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[2]。該模型制備過程中動(dòng)物的僵滯時(shí)間可反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物條件性恐懼記憶的消退程度[3]。高架十字迷宮試驗(yàn)是經(jīng)典的可以有效測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物焦慮水平的行為學(xué)測(cè)試方法[4]。通過對(duì)環(huán)境相關(guān)恐懼模型的制備發(fā)現(xiàn)，每個(gè)刺激流程大鼠均表現(xiàn)出恐懼記憶的消退，應(yīng)激后的大鼠易激惹、運(yùn)動(dòng)活力降低，高架十字迷宮測(cè)試中開臂活動(dòng)次數(shù)及時(shí)間相對(duì)減少，提示該模型大鼠焦慮狀態(tài)明顯。

中醫(yī)學(xué)沒有GAD的病名,依據(jù)GAD的病因及臨床表現(xiàn)，將其歸屬于情志疾病范疇[5]。依照具體的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)辨證認(rèn)為，該病病位主要在肝、心、脾、腎[6]，病理因素見火、痰、濕、瘀[7]多種，所涉證型有肝郁化火、心腎不交、肝郁脾虛、心脾兩虛等，其中肝郁化火證型尤為常見[8]。根據(jù)五行“木克土”及“見肝之病，知肝傳脾”理論，GAD屬肝郁者往往伴有或引發(fā)脾虛，臨床所見GAD患者往往伴神疲、乏力、倦怠、納減等脾虛表現(xiàn)，疏肝清熱健脾法因而被選作本研究的治法。丹梔逍遙散以逍遙散加牡丹皮和梔子而成方，功可疏肝健脾、清熱解郁[9]。

從模型制備過程中對(duì)僵滯時(shí)間的觀察可見，各組在每個(gè)流程不同應(yīng)激階段的僵滯時(shí)間所占百分比組內(nèi)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示大鼠在本模型制備過程中未表現(xiàn)出對(duì)恐懼記憶的長(zhǎng)期記憶效果，考慮與每個(gè)流程條件性訓(xùn)練后的恐懼消退有關(guān)。組間比較顯示，中藥疏肝清熱健脾法與丁螺環(huán)酮均可降低大鼠處于應(yīng)激環(huán)境中的僵滯時(shí)間，提示兩者對(duì)恐懼記憶的消退均有鞏固作用，但疏肝清熱健脾法比丁螺環(huán)酮起效慢。行為學(xué)測(cè)評(píng)結(jié)果顯示疏肝清熱健脾法與丁螺環(huán)酮均可提高該模型大鼠的運(yùn)動(dòng)活力，有效降低焦慮水平，并且從行為學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)來看，兩者干預(yù)效果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但治療組高架十字迷宮測(cè)試中直立次數(shù)的增多均較對(duì)照組更明顯，且治療組體重情況優(yōu)于對(duì)照組，因此認(rèn)為疏肝清熱健脾法具有與丁螺環(huán)酮同等的抗焦慮效果，且在大鼠綜合體質(zhì)及精神狀態(tài)改善方面優(yōu)于丁螺環(huán)酮。李寧等[10]以不確定性空瓶刺激建立GAD模型,并以丹梔逍遙散進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示丹梔逍遙散抗焦慮效果優(yōu)于丁螺環(huán)酮，與本研究結(jié)果有異，考慮可能與模型應(yīng)激方式不同有關(guān)，另也應(yīng)與丁螺環(huán)酮的給藥天數(shù)不同而致起效不同[11]有關(guān)。

概言之，通過環(huán)境相關(guān)恐懼應(yīng)激的方法建立模型，可以造成大鼠明顯的焦慮狀態(tài)，雖然條件性訓(xùn)練階段電擊對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有軀體刺激，但在環(huán)境相關(guān)恐懼刺激階段及改變的環(huán)境信息階段均避免軀體應(yīng)激成分，而且環(huán)境信息的不確定性有利于引發(fā)動(dòng)物情緒泛化，易于產(chǎn)生彌散而持續(xù)的焦慮,因而較好地模擬GAD的發(fā)病狀態(tài)。疏肝清熱健脾法與丁螺環(huán)酮在行為學(xué)上均表現(xiàn)出肯定的抗焦慮效果,前者在動(dòng)物整體體質(zhì)狀態(tài)改善方面效果更優(yōu)。但該模型作為GAD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型具體的神經(jīng)病理改變?nèi)杂写剿?，中藥的作用機(jī)制亦有待更深入的研究。

[1]江開達(dá).精神病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:171.

[2]Luyten L,Vansteenwegen D,van Kuyck K,et al.Contextual conditioning in rats as an animal model for generalized anxiety disorder[J].Cognitive,affective,& behavioral neuroscience,2011,11(2):228-244.

[3]Pellow S,Chopin P.Validation of open-closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat[J].J Neurosci Methods,1985,14(3):149-167.

[4]孫君輝,凌沛學(xué),蔣秋燕,等.焦慮大鼠模型的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].食品與藥品,2011,13(11):438-441.

[5]朱晨軍,包祖曉,唐啟盛.試論中醫(yī)學(xué)中的“驚悸”病與焦慮癥的關(guān)系[J].吉林中醫(yī)藥,2009,29(12):174-176.

[6]包祖曉,唐啟盛.焦慮癥中醫(yī)證治探討[J].吉林中醫(yī)藥,2008,28(3):169-170.

[7]孫文軍,唐啟盛,曲淼.從血府逐瘀湯看王清任治療焦慮癥的思想[J].吉林中醫(yī)藥,2011,31(1):1-3.

[8]唐啟盛,孫文軍,曲淼,等.運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)分析廣泛性焦慮癥的中醫(yī)證候?qū)W規(guī)律[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2012,10(9):975-982.

[9]薛己.內(nèi)科摘要[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1985:77.

[10]李寧,唐啟盛,趙瑞珍,等.慢性焦慮應(yīng)激大鼠行為學(xué)的變化及中藥丹桅逍遙散的干預(yù)作用[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,32(12):826-829.

[11]徐海婷,李惠,肖澤萍.廣泛性焦慮障礙藥物和心理治療的研究進(jìn)展[J].臨床精神醫(yī)學(xué)雜志,2013,23(3):207-209.