余成華 裴繼誠 張方東 頓秋霞 王 兵

(天津科技大學(xué)天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

流通領(lǐng)域用紙、食品及藥品包裝用紙、餐巾紙及生活用紙?jiān)谥圃?、儲藏或使用過程中可能會沾染上細(xì)菌，因而使得以上紙種在某些范圍內(nèi)的使用受到局限或影響［1］。在食品行業(yè)中，油脂酸敗是含油脂食品品質(zhì)變壞、影響食品保質(zhì)期的一個(gè)重要因素。但一般抗氧化劑的耐熱性均較差，經(jīng)過加熱，特別是在高溫油炸的條件下，很容易分解或揮發(fā)［2］。因此生產(chǎn)一種既具有抑菌作用又具有抗氧化作用的食品包裝紙成為一種新的訴求。

殼聚糖 (Chitosan，CTS)是甲殼素 (Chitin)的脫乙?；a(chǎn)物，其學(xué)名是β-(1，4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖。它是一種插線型聚合物，分子鏈中含有大量具有反應(yīng)活性的氨基和羥基［3］。殼聚糖能有效地抑制細(xì)菌和真菌的生長和繁殖，與一般抑制劑相比，具有抑菌活性高、廣譜、殺滅率高等優(yōu)點(diǎn)。目前已有研究證明，殼聚糖及其衍生物在細(xì)胞水平和動(dòng)物整體水平上具有一定的抗氧化作用［4］。其溶解性和抗氧化性較差，特別是對中、高分子質(zhì)量殼聚糖，限制了其在許多領(lǐng)域的應(yīng)用［5］。因此，對殼聚糖進(jìn)行改性成為有關(guān)殼聚糖研究的重要課題。

目前對殼聚糖的改性方式主要是化學(xué)改性，包括?；?、烷基化、羥基化、酯化、醚化、羧基化、季銨化［6］、接枝共聚［7］、Schiff堿反應(yīng)、交聯(lián)等［8］。常用醛、酰氯、酸酐、環(huán)氧化物等活性高、危害性大的試劑，對環(huán)境污染較大，同時(shí)化學(xué)法還存在著反應(yīng)步驟多、得率低、專一性差等缺點(diǎn)［9-10］。與化學(xué)催化相比，生物催化具有催化效率高、專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)［11-12］。殼聚糖的酶法接枝所用的催化劑主要有酪氨酸酶 (Tyrosinase，TYR)［13］、過氧化物酶［14］等。與其他氧化酶相比漆酶以氧分子作為電子受體，不僅具有高效率的催化效果，而且其催化的最終產(chǎn)物是水，在反應(yīng)過程中對環(huán)境影響更小。

漆酶 (Laccase)是一種結(jié)合多個(gè)銅離子的蛋白質(zhì)，屬于銅藍(lán)氧化酶。在氧氣存在下，漆酶可以使酚型結(jié)構(gòu)單元失去一個(gè)電子形成酚氧游離基，進(jìn)而形成醌型結(jié)構(gòu)［15］，醌可以與殼聚糖上的氨基基團(tuán)發(fā)生化學(xué)鍵連接，目前對該反應(yīng)歷程尚不清楚，但普遍認(rèn)為醌與氨基通過席夫堿或邁克爾加成反應(yīng)機(jī)理發(fā)生共價(jià)作用［16］。

香蘭素 (Vanillin，VA)又名香草醛，天然存在于許多植物和有機(jī)物質(zhì)中，具有香子蘭特有的甜美香氣，廣泛用于食品、化妝品、個(gè)人衛(wèi)生用品、去污劑、香水、農(nóng)用化學(xué)品、防曬產(chǎn)品等。近幾年還發(fā)現(xiàn)香草醛具有很好的抗氧化活性和抗腫瘤活性，能夠防止食物變質(zhì)［17］。研究表明香草醛在細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)中具有清除過氧化物和自由基的抗氧化作用。

本實(shí)驗(yàn)選取香草醛作為接枝物，通過漆酶催化氧化作用，將香草醛接枝于殼聚糖上，提高VA-殼聚糖的抗氧化性能和抑菌性能;并采用漿內(nèi)添加法和表面涂布法制備抗菌紙，考察VA-殼聚糖對抗菌紙抗菌性能以及物理性能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

漆酶，商品號NOVOZYME 51003，酶活1070 U/mL，由諾維信公司提供。酶活用以丁香醛連氮 (Syringldazine)的氧化率為基準(zhǔn)的漆酶單位LAMU表示，1個(gè)漆酶單位 (LAMU)是指在給定的分析條件下(pH值7.5、30℃)每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol丁香醛連氮所需酶量。香草醛 (VA);殼聚糖，脫乙酰度≥95%，黏度 100 ～200 mPa·s;2，2-聯(lián)氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽 (ABTS)，均購于Sigma-Aldrich公司;其他試劑購于天津市化學(xué)試劑一廠;漂白硫酸鹽針葉木漿，智利銀星牌商品漿。

VECTOR 22傅里葉變換紅外光譜儀 (FT-IR)，德國布魯克儀器公司;ZD-2型自動(dòng)電位滴定儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;UV-2550紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司;RK-2A-KWT型快速紙頁成形器，奧地利PTI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 漆酶催化氧化VA-殼聚糖的接枝反應(yīng)

將殼聚糖粉末分散于100 mL緩沖溶液 (100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值6.5)中，并在40℃下不斷搖晃，然后依次加入6 mL溶有香草醛 (10 mmol/L)的甲醇溶液和漆酶 (214 U)，在整個(gè)反應(yīng)過程中通氧，反應(yīng)4 h。反應(yīng)后，分別用甲醇、乙醇和水對VA-殼聚糖進(jìn)行徹底漂洗，真空干燥后儲存于4℃下備用分析。對照組的樣品在沒有加香草醛的條件下，以相同的方式進(jìn)行處理［16］。

1.2.2 接枝率的測定

采用線性電位滴定法［18］測定VA-殼聚糖中的自由氨基含量。根據(jù)反應(yīng)前后自由氨基含量的變化即可測得接枝率，即:

式中，D1為VA-殼聚糖的脫乙酰度 (即自由氨基含量);D0為殼聚糖對照樣 (緩沖溶液處理樣)的脫乙酰度 (即自由氨基含量);D為殼聚糖原樣(未處理樣)的脫乙酰度 (即自由氨基含量)。

1.2.3 紅外光譜 (FT-IR)分析

將殼聚糖原樣及VA-殼聚糖進(jìn)行FT-IR分析，掃描范圍:4000～500 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描 16次，環(huán)境氣體為空氣。

1.2.4 ABTS·+自由基的清除

將殼聚糖原樣以及VA-殼聚糖溶于0.1 mol/L醋酸中，濃度分別為0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、2.5 mg/mL;將7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，并在室溫下無光儲存12 h，得到ABTS·+自由基溶液。在使用之前，ABTS·+溶液用pH值7.4磷酸鹽緩沖液稀釋，在734 nm下達(dá)到0.700±0.025的吸光度［16］。在裝有2 mL 的 ABTS·+溶液的試管中，加入不同濃度的殼聚糖溶液2 mL，搖勻，25℃下避光靜置10 min，在734 nm處測量吸光度，并用式 (2)計(jì)算ABTS·+自由基的清除率 (%)。

式中，A0為ABTS·+初始濃度的吸光度;A1為添加殼聚糖溶液后清除ABTS·+后濃度的吸光度。

1.2.5 還原能力的測定

對文獻(xiàn)［19］的方法稍做改進(jìn)來測定還原能力。取2 mL不同濃度的樣品，加入0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH值6.6)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混勻，50℃水浴20 min后迅速冷卻，加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液，混勻后在2000 r/min下離心10 min，取上清液2 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10 min后在700 nm處測定吸光度。

1.2.6 抑菌性能檢測

采用牛津杯法檢測殼聚糖及VA-殼聚糖的抑菌能力。首先取菌濃為105～106CFU/mL的指示菌培養(yǎng)物0.1 mL滴加到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板 (直徑為90 mm)上，采用涂布棒將平板均勻涂滿，自然干燥30 min，然后將已消毒的牛津杯均勻放置在平板上，每個(gè)平板放4個(gè)，向其中加入采用0.1 mol/L鹽酸溶解的VA-殼聚糖0.2 mL(待測樣品濃度分別為1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL)，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

1.2.7 抗菌紙的制備

(1)漿內(nèi)添加法

分別向紙漿中加入殼聚糖原樣及VA-殼聚糖粉末，用量分別為0.2%、0.5%、0.8%、1.0%(相對于絕干漿量)，同時(shí)加入0.08%(相對絕干漿量)陽離子聚丙烯酰胺 (CPAM)作為助留劑，與漿料混合均勻后，采用快速紙頁成形器抄造定量為60 g/m2的紙張。

(2)表面涂布法

稱取一定量的淀粉置于三口燒瓶中，以1%(相對淀粉絕干量)的比例加入過硫酸銨，然后加入一定量的蒸餾水后在恒溫水浴鍋中90℃的溫度下進(jìn)行糊化1 h，得到柔軟、透明、均一的淀粉涂布液。將殼聚糖原樣及 VA-殼聚糖粉末分別按照 0.2%、0.5%、0.8%、1.0%(相對絕干漿量)加入到淀粉中，攪勻后，用5#涂布棒將其涂布于所抄空白紙的表面，自然干燥。

1.2.8 紙張抑菌性能檢測

采用改良奎因法檢測紙張的抑菌效果。將指示菌配成105～106CFU/mL的菌懸液，備用。將紙樣裁成大小為25 mm×25 mm的紙片放入直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，均勻滴加0.5 mL菌液置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)干燥1 h，干燥后的紙張平貼于營養(yǎng)瓊脂平板表面，再用半固體營養(yǎng)瓊脂均勻覆蓋紙樣表面，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。采用活菌計(jì)數(shù)法測定其活菌數(shù)，并用式 (3)計(jì)算抑菌率K。

式中，A為從空白樣回收的平均菌數(shù);B為從抗菌紙回收的平均菌數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 接枝率測定

接枝率是指殼聚糖進(jìn)行接枝反應(yīng)生成殼聚糖衍生物時(shí)，氨基被接枝的比例。接枝率反映原料向產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化程度。采用線性電位滴定法分別對殼聚糖原樣、殼聚糖對照樣以及VA-殼聚糖進(jìn)行滴定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。根據(jù)圖1，按照文獻(xiàn) ［18］方法計(jì)算在本實(shí)驗(yàn)條件下，殼聚糖原樣的總氨基含量約為8.8%，殼聚糖對照樣 (緩沖溶液處理樣)氨基含量為7.2%，VA-殼聚糖的氨基含量為6.3%，本實(shí)驗(yàn)條件下測得其接枝率約為10.2%。

2.2 FT-IR分析

殼聚糖原樣和VA-殼聚糖的FT-IR圖如圖2所示。從圖2中可知，殼聚糖原樣在3440 cm－1處附近有吸收帶是—OH和—NH的伸縮振動(dòng)，2875 cm－1處為C—H伸縮振動(dòng)吸收峰，1596 cm－1處為氨基N—H變形振動(dòng)峰;1421 cm－1處為—NH3+彎曲振動(dòng)［20］，1384 cm－1和1324 cm－1處為氨基葡萄糖單元上—NH的彎曲振動(dòng)［21］，1261 cm－1處為 C—O和 C—C伸縮振動(dòng)，1155 cm－1處為C—O—C的反對稱伸縮振動(dòng)，1080 cm－1處是包含C—O結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng);VA-殼聚糖在 3400 cm－1、1421 cm－1、1384 cm－1和 1324 cm－1處吸收減弱，1596 cm－1處吸收消失，這些吸收峰的變化表明殼聚糖上氨基的減少，與漆酶催化香草醛的產(chǎn)物和殼聚糖氨基基團(tuán)之間發(fā)生共價(jià)反應(yīng)相符［5］，并且在1637 cm－1處出現(xiàn)CN伸縮振動(dòng)峰，歸因于殼聚糖上氨基基團(tuán)和酚羥基基團(tuán)之間形成席夫堿鍵［22］。這些在光譜中的變化表明通過漆酶催化氧化香草醛的產(chǎn)物與殼聚糖上的氨基基團(tuán)之間受到席夫堿型的共價(jià)修飾。

圖1 殼聚糖接枝前后氨基含量的測定

圖2 殼聚糖原樣和VA-殼聚糖FT-IR圖

2.3 ABTS·+自由基的清除

ABTS自由基清除法［23］目前也已被廣泛應(yīng)用于生物樣品的總抗氧化能力的測定。在此反應(yīng)體系中，ABTS經(jīng)氧化后生成相對穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS·+水溶性自由基，且在734 nm處具有典型的特征吸收峰?？寡趸瘎┡cABTS·+自由基反應(yīng)后使其溶液褪色，特征吸光值降低。溶液吸光值越低則表明所檢測物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)。在本實(shí)驗(yàn)中，對ABTS·+溶液進(jìn)行紫外可見分光光度計(jì) (UV-Vis)掃描，結(jié)果如圖3所示。殼聚糖原樣對ABTS·+溶液的清除作用較低，原因可能是因?yàn)闅浞肿觾?nèi)和分子間的連接抑制了自由基的清除，而VA-殼聚糖對ABTS·+溶液的清除作用有了明顯的提高，在濃度為2.5 mg/mL時(shí)VA-殼聚糖對ABTS·+溶液的清除作用達(dá)到了75.7%，相比未改性提高了59.5%。其對ABTS·+自由基清除率的IC50(半數(shù)抑制濃度)為1.62 mg/mL。由此證明，漆酶催化VA-殼聚糖接枝的產(chǎn)物，可使其抗氧化活性得到明顯增強(qiáng)。

圖3 不同濃度殼聚糖原樣和VA-殼聚糖對ABTS·+自由基清除的影響

2.4 還原能力測定

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，研究表明抗氧化活性和還原能力之間存在著密切的關(guān)系，在一般情況下，還原特性與還原酮的存在有關(guān)，通過提供一個(gè)氫原子以打破自由基鏈而表現(xiàn)出抗氧化性能［24］。殼聚糖原樣及VA-殼聚糖的還原能力如圖4所示。從圖4可知，隨著濃度的增加，殼聚糖原樣的吸光度值增加不顯著，其表現(xiàn)出的還原力幾乎可以忽略不計(jì)。而改性后的VA-殼聚糖隨著濃度的增加，吸光度值隨之增加，還原能力逐漸增強(qiáng)。VA-殼聚糖在濃度為5 mg/mL時(shí)在700 nm處的吸光度為0.502，較殼聚糖原樣提高0.321。

圖4 不同濃度殼聚糖原樣和VA-殼聚糖的還原能力

2.5 殼聚糖抑菌性能檢測

表1列出了殼聚糖原樣和VA-殼聚糖對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌活性。從表1可知，在濃度為1 mg/mL時(shí)，VA-殼聚糖較殼聚糖原樣對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈分別提高了1.5 mm和1.3 mm;在濃度為5 mg/mL時(shí)，VA-殼聚糖較殼聚糖原樣對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別提高了3.8 mm和4.0 mm。

這通常是因?yàn)闅ぞ厶侵袔в姓姾傻陌被鶊F(tuán)，易與呈負(fù)電性的菌體相吸附，一方面是由于殼聚糖可以透過微生物細(xì)胞壁進(jìn)入到菌體內(nèi)部，與細(xì)菌生存所必需的微量元素、金屬元素或蛋白質(zhì)等結(jié)合，破壞其代謝平衡，從而抑制微生物的生長和繁殖［25］;也可能同時(shí)與DNA形成穩(wěn)定的混合物，干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄［26-28］。另一方面是由外部對菌體細(xì)胞發(fā)生作用，使菌體細(xì)胞聚沉，高分子鏈密集于細(xì)菌菌體表面，使其變性或在細(xì)胞表面形成一層高分子膜，影響細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，阻止代謝廢物的排泄，導(dǎo)致菌體的新陳代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致菌體死亡［29］。通過Schiff鍵的接枝引入酚類物質(zhì)，一方面由于攜帶有Schiff堿等疏水性基團(tuán)的抗菌劑因與細(xì)菌膜有更好的親和性，從而可提高抗菌活性;另一方面由于進(jìn)行亞結(jié)構(gòu)修飾，通過增加抑菌活性中心的數(shù)量，提高抑菌活性［30］，使得VA-殼聚糖與細(xì)菌膜有更好的親和性，從而提高VA-殼聚糖對細(xì)菌的抑菌性能。

由表1可知，殼聚糖原樣及VA-殼聚糖的抑菌性能不隨著濃度的增大而增大。這可能是由于低濃度的殼聚糖聚陽離子更容易接近細(xì)菌并與之結(jié)合，從而發(fā)生凝聚，而高濃度會出現(xiàn)類似于混凝過程中的“再穩(wěn)”現(xiàn)象;另一種解釋基于殼聚糖可能會引起細(xì)胞壁通透性改變的抑菌機(jī)理假設(shè)，認(rèn)為高濃度殼聚糖在細(xì)胞壁表面形成的致密包裹層可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)泄漏量降低［31］。

2.6 紙張抑菌性能檢測

2.6.1 漿內(nèi)添加法

圖5為漿內(nèi)添加法制得的抗菌紙對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌率。從圖5可以看出，VA-殼聚糖抗菌紙對4種細(xì)菌的抑菌率較殼聚糖原樣都有所提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在VA-殼聚糖用量較小時(shí)就具有良好的抑菌性能，但抑菌率不隨著VA-殼聚糖用量的增加而增加，這可能是由于當(dāng)用量增大時(shí)殼聚糖顆粒容易相互絮聚而影響了其抑菌性能［31］。

表1 殼聚糖原樣和VA-殼聚糖抑菌性能檢測

2.6.2 表面涂布法

圖6為表面涂布法制得的抗菌紙對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌率。從圖6可以看出，VA-殼聚糖制得的抗菌紙對4種細(xì)菌的抑菌率較殼聚糖原樣都有所提高，表明該抗菌紙對這幾種微生物的抵抗性良好。

圖5 漿內(nèi)添加法抗菌紙抑菌率

2.7 抗菌紙物理性能比較

表2、表3分別為不同處理方式對抗菌紙抗張指數(shù)、耐破指數(shù)、撕裂指數(shù)的影響。從表2、表3可知，抗菌紙的抗張指數(shù)、耐破指數(shù)與原紙相比略有提高，撕裂指數(shù)有所降低。其原因可能是因?yàn)樘幚砗蟮募垙垼瑲ぞ厶窃瓨蛹癡A-殼聚糖與纖維上的羥基形成氫鍵，使抗菌劑牢固地吸附在纖維表面;同時(shí)，由于殼聚糖的聚陽離子性，能夠與帶負(fù)電的纖維發(fā)生吸附作用，表現(xiàn)為在纖維表面上牢固地附著在纖維表面，從而有利于纖維間結(jié)合力的提高［1］。

表2 漿內(nèi)添加法抗菌紙物理性能

圖6 表面涂布法抗菌紙抑菌率

表3 表面涂布法抗菌紙物理性能

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用漆酶催化香草醛 (VA)與殼聚糖接枝反應(yīng)，以提高殼聚糖的抗氧化性能和抗菌性能;并采用漿內(nèi)添加法和表面涂布法制備抗菌紙。

3.1 實(shí)驗(yàn)中的酶促反應(yīng)是在溫和的條件下與固體殼聚糖顆粒進(jìn)行反應(yīng)，測得 VA-殼聚糖的接枝率約為10.2%。

3.2 紅外光譜 (FT-IR)分析表明，在漆酶催化作用下香草醛與殼聚糖上的氨基參加反應(yīng)形成席夫堿(CN)結(jié)構(gòu)。

3.3 VA-殼聚糖對 2，2-聯(lián)氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽自由基(ABTS·+自由基)半數(shù)抑制濃度(IC50)值為1.62 mg/mL，還原能力檢測得出濃度為5 mg/mL時(shí)在700 nm處的吸光度較殼聚糖原樣提高0.321，表明VA-殼聚糖的抗氧化性能得到提高;同時(shí)VA-殼聚糖對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性有所改善。

3.4 紙張經(jīng)漿內(nèi)添加和表面涂布VA-殼聚糖后，制備的抗菌紙對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能均有所提高。

3.5 與原紙相比，抗菌紙的抗張指數(shù)、耐破指數(shù)略有提高，但撕裂指數(shù)有所降低。

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