劉平平， 朱錦燦， 鄭 力， 劉善淘， 譚廣銷(xiāo)， 何冬梅， 劉革修△

(1清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液腫瘤科，北京 100016； 2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所, 廣東 廣州 510632)

Burkitt淋巴瘤是一種罕見(jiàn)而又高度惡性的非霍奇金淋巴瘤，約占成人非何杰金淋巴瘤的1%～5%。雖然利妥昔單克隆抗體使Burkitt淋巴瘤患者的總生存率有了明顯提高，但是化療依然是本病主要的治療方案。然而化療仍然存在多種不良反應(yīng)，如高強(qiáng)度阿糖胞苷(cytosine arabinoside，Ara-C)可導(dǎo)致骨髓抑制、高尿酸血癥、骨骼和肌肉疼痛、咽痛、發(fā)熱、全身不適等。所以，進(jìn)一步研究提高療效方案，增強(qiáng)其對(duì)化療藥物敏感性，對(duì)治療具有重要意義。最近研究[1-6]發(fā)現(xiàn)miR-155在腫瘤中高表達(dá)可能直接或間接地抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，如其在小兒Burkitt淋巴瘤、彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤、原發(fā)縱隔B細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常循環(huán)中B細(xì)胞，而且表達(dá)水平高者預(yù)后較差。本研究將通過(guò)觀察miR-155特異性siRNA對(duì)Ara-C誘導(dǎo)Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞凋亡的影響，為Burkitt 淋巴瘤的臨床治療研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

LipofectamineTM2000購(gòu)于Invitrogen；miR-155 siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)及合成；miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒和miRcute miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)于同仁化學(xué)研究所; 阿糖胞苷購(gòu)于蘇州市尤利特生物醫(yī)藥科技有限公司；annexin V/PI雙染試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于HyClone;Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將Raji細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、溶媒對(duì)照組、Ara-C組(濃度分別為：2.5、5、10、20 mg/L)、siRNA組(濃度分別為：0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μmol/L)和Ara-C+siRNA組，根據(jù)LipofectamineTM2000操作說(shuō)明進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2×107/L密度接種于96孔板中, 每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后采用CCK-8法檢測(cè)，并通過(guò)以下公式計(jì)算增殖抑制率：增殖抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A450-正常組A450)/正常組A450]×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3qRT-PCR檢測(cè)miR-155的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5×107/L密度接種于6孔板中, 每孔2 000 μL，以1.0 μmol/L siRNA轉(zhuǎn)染干預(yù)， 24 h后，收集細(xì)胞，加入miRcute miRNA提取分離試劑盒提取miRNA，經(jīng)純度及電泳檢測(cè)后，根據(jù)miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒操作說(shuō)明，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)miR-155的表達(dá)，以U6 snRNA為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行miR-155相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。其中，U6 snRNA上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。miR-155上游引物5’-GCGGTTAATGCTAATCGTGAT-3’，下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

2.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè) Annexin V-PI 雙染觀察經(jīng)不同處理后的Raji細(xì)胞凋亡率。取轉(zhuǎn)染48 h后各組Raji細(xì)胞， 加入195 μL annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL annexin V-FITC輕輕打勻，室溫避光孵育10 min，離心棄上清，190 μL annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10 μL PI染色液，冰浴避光，行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.5Western blotting印跡法檢測(cè) Ara-C(5 mg/L)單獨(dú)或聯(lián)合miR-155 siRNA處理Raji細(xì)胞48 h，收集并PBS洗2遍，加入蛋白抽提液抽提總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，常規(guī)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉液封閉1 h。鼠抗人caspase-3和GAPDH抗體4 ℃過(guò)夜，1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記Ⅱ抗室溫孵育1 h，用TBST洗3次，ECL顯色液顯色。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比較采用SNK-q或Tukey檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后miR-155表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染后24 h，提取總RNA，qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-155的表達(dá)水平，見(jiàn)圖 1。其中miR-155 siRNA組(siRNA group)分別與未轉(zhuǎn)染組(normal group)及無(wú)義轉(zhuǎn)染組(scrambled control group)相比，miR-155表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，未轉(zhuǎn)染組與無(wú)義序列轉(zhuǎn)染組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)。

Figure 1. The relative expression of miR-155 in Raji cells after transfection with miR-155 siRNA.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal group.

2 miR-155 siRNA與Ara-c單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)Raji細(xì)胞增殖的抑制作用

CCK-8結(jié)果顯示，miR-155 siRNA單獨(dú)處理Raji細(xì)胞顯現(xiàn)出一定程度的增殖抑制作用，不同濃度的Ara-C均顯示出增殖抑制性，并呈量效關(guān)系，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)，miR-155 siRNA與Ara-C聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞后，增殖抑制率明顯高于相應(yīng)Ara-C,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。這表明轉(zhuǎn)染miR-155 siRNA入Raji細(xì)胞后可使Ara-C抑制增殖的作用明顯增強(qiáng)。

Figure 2. Ara-C alone or in combination with miR-155 siRNA inhibited the proliferation of Raji cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs Ara-C group.

3 Annexin V-PI 雙標(biāo)記檢測(cè)Raji細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示siRNA+Ara-C組凋亡率為 (38.4±1.4)%；Ara-C組、siRNA組凋亡率分別為 (16.5±0.3)%和 (14.6±0.3)%。siRNA+Ara-C組與Ara-C組、siRNA組及對(duì)照組[(3.6±0.4)%]相比都有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)圖3。這表明miR-155 siRNA與Ara-C聯(lián)合作用比單用miR-155 siRNA或Ara-C顯示出更強(qiáng)的誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的作用。

Figure 3. The effects of Ara-C alone or combined with miR-155 siRNA on the apoptosis of Raji cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs Ara-C group.

4 miR-155 siRNA聯(lián)合阿糖胞苷對(duì)Raji細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與Ara-C(5 mg/L)單獨(dú)使用相比，Ara-C(5 mg/L)與miR-155 siRNA聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞，其caspase-3蛋白的表達(dá)顯著增加，見(jiàn)圖4。

Figure 4. The effects of Ara-C or combined with miR-155 siRNA on the protein expression of caspase-3 in Raji cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs Ara-C group.

討 論

miRNA以不完全互補(bǔ)的方式與靶基因mRNA的3’UTR結(jié)合，調(diào)控多個(gè)靶基因，或多個(gè)miRNA共同調(diào)節(jié)一些特殊的靶基因[7]。siRNA是兩端各有2個(gè)堿基突出并小于25個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA。采用RNAi技術(shù)在多種白血病細(xì)胞系中封閉白血病特異癌基因的表達(dá)已有報(bào)道[8]。因此，通過(guò)siRNA技術(shù)封閉與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA的表達(dá)具有良好的研究前景。

miR-155位于21號(hào)染色體，由來(lái)自于B細(xì)胞整合簇上非編碼RNA的外顯子轉(zhuǎn)錄而形成[9-11]，在小兒Burkitt淋巴瘤的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常。Yamanaka等[12]研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-155在淋巴瘤中的治療具有良好的應(yīng)用前景。另有研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞淋巴瘤高表達(dá)miR-155，并進(jìn)而導(dǎo)致了PTEN、PDCD4和SHIP1低表達(dá)以及AKT(Ser473)高磷酸化，通過(guò)反義寡核苷酸干擾miR-155表達(dá)后可提高PTEN、PDCD4和SHIP1表達(dá)，下調(diào)AKT(Ser473)磷酸化，抑制腫瘤增殖，提示miR-155在淋巴瘤發(fā)病及治療方面有重要作用[13]。阿糖胞苷是一種細(xì)胞周期特異性藥物，通過(guò)干擾細(xì)胞增殖S期的嘧啶類(lèi)代謝，抑制細(xì)胞增殖。阿糖胞苷進(jìn)入人體后經(jīng)激酶磷酸化為阿糖胞苷三磷酸及阿糖胞苷二磷酸，前者可抑制 DNA 聚合酶的合成，后者則抑制二磷酸胞苷轉(zhuǎn)變?yōu)槎姿崦撗醢眨瑥亩种萍?xì)胞 DNA 聚合及合成[14]。研究報(bào)道，caspase-3是miR-155的靶點(diǎn)[15]。

本研究通過(guò)應(yīng)用miR-155 siRNA和Ara-C單獨(dú)及聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞，觀察miR-155 siRNA能否增強(qiáng)Ara-C對(duì)Raji細(xì)胞的增殖凋亡作用。在本研究中，將miR-155 siRNA轉(zhuǎn)染至Raji細(xì)胞后能顯著干擾miR-155的表達(dá)。接著通過(guò)CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-155 siRNA與Ara-C聯(lián)合作用較單獨(dú)使用miR-155 siRNA或Ara-C有更明顯的抑制增殖作用。為了探討聯(lián)合作用對(duì)Raji細(xì)胞凋亡的影響，行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用miR-155 siRNA能顯著增強(qiáng)Ara-C單獨(dú)使用時(shí)誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的作用。具體機(jī)制則與miR-155 siRNA通過(guò)抑制miR-155表達(dá)而上調(diào)caspase-3的表達(dá)有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。

綜上所述，miR-155 siRNA與阿糖胞苷聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞可增強(qiáng)阿糖胞苷的抑制增殖作用及促凋亡作用。本研究結(jié)果為今后臨床Burkitt 淋巴瘤治療研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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