戴 兵， 范時(shí)洋， 陳 龍， 金海東， 蔡建武， 潘 駿

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科, 浙江 溫州 325027)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有多向分化潛能，特定培養(yǎng)條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等中胚層組織[1]，是組織工程理想的種子細(xì)胞。鑒于自體細(xì)胞臨床大范圍應(yīng)用的限制，異體種子細(xì)胞的免疫逃逸問題是組織工程發(fā)展無法回避的問題之一。MSCs隨具有低免疫原性，但植入體內(nèi)的干細(xì)胞可以分化為多種類型的細(xì)胞，干細(xì)胞的分化是否影響其免疫原性的表達(dá)，這是我們要考慮的問題。對(duì)影響細(xì)胞移植成功的主要障礙是T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。MHC I分子和CD8+T細(xì)胞的相互作用在同種異體或異種移植的排斥反應(yīng)中起到重要作用[2-3]。BMSCs只表達(dá)MHCⅠ，不表達(dá)MHCⅡ， MHCⅠ在免疫系統(tǒng)中占有極其重要的地位，廣泛表達(dá)于一切有核細(xì)胞表面，由重鏈α鏈和輕鏈β2-微球蛋白(beta 2-microglobulin, β2M)組成。 β2M是一種低分子量的蛋白質(zhì)，與重鏈ɑ鏈以非共價(jià)鍵連接方式相連，使MHCⅠ在細(xì)胞表面能夠穩(wěn)定表達(dá)，并能促進(jìn)抗原肽與MHCⅠ結(jié)合[4-6]。RNAi技術(shù)是特異性降解與其序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA[7]。近年來，使用RNAi技術(shù)阻斷特定基因的表達(dá)比反義寡核苷酸等更特異、高效、穩(wěn)定和低濃度[8-9]。通過RNAi減少或下調(diào)MHC I分子蛋白的表達(dá)，成功克服了一些限制細(xì)胞治療的免疫反應(yīng)[10]。我們擬通過RNAi技術(shù)使預(yù)分化BMSCs的β2M沉默，降低β2M蛋白的表達(dá)，為軟骨組織工程提供低免疫原性的種子細(xì)胞。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和材料

健康雄性清潔級(jí)4周齡SD大鼠10只，體質(zhì)量200～240 g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)內(nèi)容通過了溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的審批。

低糖DMEM和胎牛血清購自Sigma；SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)液購自廣州賽業(yè)；抗生素和抗真菌劑溶液購自Life Technologies；Lipofectamine 2000購自Gibco；FAM-siRNA及轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑均購自上海吉瑪公司;siRNA的序列見表1；β2M 抗體和兔抗羊 IgG-HRP均購自 Santa Cruz；GAPDH antibody購自Bioworld；總RNA快速提取試劑盒購自Generay；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas；qPCR試劑IQ SYBR Green Supermix購自Bio-Rad。所用引物由上海英濰捷基(Invitrogen)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見表2。

表1 siRNA序列

表2 引物序列

2 主要方法

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 無菌操作下取4周齡SD大鼠股骨及脛骨干，用一次性注射器吸取無血清DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻后移入25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后除去未貼壁細(xì)胞，以后每3～4 d更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上，0.25%胰酶/0.1% EDTA消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，按1∶3傳代培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo) 取第3代MSCs加入含10% FBS成軟骨誘導(dǎo)液(含基本培養(yǎng)基97 mL, 地塞米松10 μL, 抗壞血酸鹽300 μL, 胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒1 mL, 丙酮酸鈉鹽100 μL, 脯氨酸100 μL, TGF-β31 mL)，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d更換培養(yǎng)基，誘導(dǎo)21 d，終止誘導(dǎo)。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)所需β2MsiRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，實(shí)驗(yàn)分為5組：實(shí)驗(yàn)組3組，分為siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3組；對(duì)照組2組，分為空白對(duì)照組 (negative control,NC)和非特異siRNA組(non-specific siRNA,NS)。取成軟骨誘導(dǎo)21 d的MSCs，種植于放置細(xì)胞爬片的24孔板中(5×104cells/well)，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)組和非特異siRNA組每孔轉(zhuǎn)染體積100 μL(轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 2000說明書)，對(duì)照組每孔加等體積的無血清opti-MEM I培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)。

2.4Western blotting法檢測(cè)β2M蛋白表達(dá) 冷的PBS洗滌細(xì)胞2遍，冰上裂解細(xì)胞、離心并收集上清后行蛋白定量，采用10% SDS-PAGE凝膠電泳。蛋白分離后經(jīng)恒流電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，使用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫封閉1 h，與β2M抗體4 ℃孵育過夜，次日加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL發(fā)光液，移入凝膠成像分析儀，化學(xué)光敏模式曝光顯影。

2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收集各組細(xì)胞，總RNA抽提按Trizol試劑說明書操作，分光光度計(jì)測(cè)量RNA的純度及濃度，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green染色法，以各組cDNA為模板，加入緩沖液、引物等進(jìn)行PCR，各樣本重復(fù)3次。反應(yīng)條件如下：95 ℃變性2 min,95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)40次。

2.6激光共聚焦顯微鏡下觀察β2M 取對(duì)照組和siRNA-3組細(xì)胞用PBS洗2遍，5% BSA 室溫封閉1 h，PBS洗3遍。孵育β2M熒光Ⅰ抗, 37 ℃避光1 h, PBS洗2遍。10 μL DiI染色, 室溫, 避光15 min, PBS洗2遍，30%甘油封片。

2.7甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白聚糖多聚體 轉(zhuǎn)染24 h后，吸去原液， PBS 洗細(xì)胞3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗細(xì)胞2遍，加入 1 mL 甲苯胺藍(lán)染液覆蓋細(xì)胞表面，室溫下孵育 30 min，PBS 洗細(xì)胞2遍，常規(guī)乙醇脫水、透明及30%甘油封片。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，拍照。

2.8Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ,Col Ⅱ)免疫熒光 轉(zhuǎn)染12 h后，吸去原液， PBS 洗細(xì)胞3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗細(xì)胞2遍，0.2% Triton X-100破膜30 min，PBS 洗細(xì)胞2遍；5% BSA固定1 h，PBS洗細(xì)胞2遍；以0.1% Triton X-100稀釋Col II Ⅰ抗(1∶100)，37 ℃孵育細(xì)胞1 h，PBS洗細(xì)胞2遍；以0.1% Triton X-100 稀釋FITC熒光Ⅱ抗(1∶500)，37 ℃孵育細(xì)胞1 h，PBS洗細(xì)胞2遍；以10 μg/L的DAPI標(biāo)記孵育15 min，標(biāo)記細(xì)胞核，PBS洗細(xì)胞2遍；熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同siRNA對(duì) β2M mRNA表達(dá)的影響

將MSCs成軟骨誘導(dǎo)21 d后，進(jìn)行siRNA干擾。siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3各轉(zhuǎn)染組均比對(duì)照組細(xì)胞的β2M mRNA表達(dá)有不同程度降低。siRNA-3組細(xì)胞的目的基因表達(dá)減少最明顯，siRNA-2和siRNA-1次之(P<0.01)，見圖1。

2 不同siRNA對(duì) β2M蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果表明,siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3各轉(zhuǎn)染組均比對(duì)照組細(xì)胞的β2M蛋白表達(dá)有不同程度降低。siRNA-3組細(xì)胞目的蛋白含量減少最明顯，siRNA-2和siRNA-1次之(P<0.01)，表明用3種siRNA均成功沉默BMSCs的β2M基因表達(dá)，siRNA-3的沉默效果最佳，見圖2。

Figure 1. The mRNA expression of β2M in the pre-differentiated (21 d) BMSCs determined by real-time qPCR analysis.NC: negative control; NS: non-specific siRNA; 1: siRNA-1; 2: siRNA-2; 3: siRNA-3.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs NC or NS.

Figure 2. The protein expression of β2M in the pre-differentiated (21 d) BMSCs determined by Western blotting.NC: negative control; NS: non-specific siRNA; 1: siRNA-1; 2: siRNA-2; 3: siRNA-3.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs NC or NS.

3 激光共聚焦顯微鏡下觀察β2M

成軟骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)21 d后，對(duì)照組和siRNA-3 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的β2M分布均比較均勻， siRNA-3 轉(zhuǎn)染組的BMSCs相比未轉(zhuǎn)染組β2M明顯減少，表明β2MsiRNA可有效沉默β2M基因的表達(dá)，見圖3。

Figure 3. The protein expression of β2M in the pre-differentiated (21 d) BMSCs observed by laser confocal microscopy.Scale bar = 50 μm.

4 甲苯胺藍(lán)法染色觀察

甲苯胺藍(lán)法染色顯示：成軟骨誘導(dǎo)21 d后，NC組和siRNA-3組的BMSCs蛋白聚糖多聚體染色均呈陽性反應(yīng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. Aggrecan production in the pre-differentiated (21 d) BMSCs detected by toluidine blue staining. Scale bar = 50 μm.A: NC; B: siRNA-3.

5 Ⅱ型膠原免疫熒光

Ⅱ型膠原免疫熒光顯示：成軟骨預(yù)誘導(dǎo)21 d后，BMSCs呈多角形，細(xì)胞形態(tài)清晰，NC組預(yù)誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞的Ⅱ型膠原免疫熒光強(qiáng)度較siRNA-3轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞略低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

討 論

在長(zhǎng)期移植過程中，考慮到免疫反應(yīng)，自體細(xì)胞是理想的移植供體細(xì)胞。其中，BMSCs因其在哺乳動(dòng)物體中含量豐富，具有顯著的優(yōu)勢(shì)。BMSCs因其取材方便、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，具有多向分化潛能、不涉及倫理道德問題等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注[11]。然而自體移植前，細(xì)胞的分離、擴(kuò)增往往十分耗時(shí)。這種情況下，同種異體BMSCs因其低免疫原性而成為軟骨移植較好的種子來源。BMSCs移植應(yīng)用于臨床將是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程，一旦應(yīng)用于臨床，那么對(duì)患者來說有很大好處。充足的種子細(xì)胞儲(chǔ)存，避免了不必要的自體細(xì)胞分離擴(kuò)增，更能滿足不適合自體BMSCs移植的老人的需求。近年來越來越多的研究主要集中在同種異體BMSCs的使用上。

Figure 5. Collagen type II in the pre-differentiated (21 d) BMSCs detected by immunofluorescence. Scale bar = 50 μm.A: NC; B: siRNA-3.

來源于成人的BMSCs已被證明具有免疫調(diào)節(jié)活性。比如可以抑制T細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)B細(xì)胞功能和樹突狀細(xì)胞的成熟[12]。但是移植的異體BMSCs在特定環(huán)境分化過程中，免疫原性是否發(fā)生變化呢？Huang等[13]發(fā)現(xiàn)預(yù)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比未分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，增加了免疫原性。其他研究小組證實(shí)，將異體間充質(zhì)干細(xì)胞移植到幼齡小鼠[14-15]和豬[16]體內(nèi)會(huì)引起免疫反應(yīng)。這說明植入的同種異體BMSCs雖然具有低免疫原性，但在體內(nèi)分化過程中，其免疫原性是增加的，使得它們更易受到免疫排斥。

Isakova等[17]發(fā)現(xiàn)將MHCⅠ陽性的雄性獼猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到雌性幼齡獼猴中樞系統(tǒng)，引起急性移植排斥反應(yīng)。但是敲除MHCⅠ或MHCⅡ或兩者同時(shí)敲除的小鼠胚胎神經(jīng)元，其免疫原性降低，移植到大鼠腦中可長(zhǎng)期存活[18-19]，這些證據(jù)說明，抑制MHCⅠ的表達(dá)對(duì)于BMSCs移植的安全性至關(guān)重要。MHCⅠ分子存在于所有有核細(xì)胞，包括重鏈α鏈和輕鏈β2M，α鏈和β2M都是MHCⅠ分子折疊、加工所必須的。有研究表明在缺乏β2M的情況下，細(xì)胞的表面不能有效表達(dá)MHC I分子[20-21]，這為降低細(xì)胞免疫原性提供了新的途徑。

siRNA具有高效、特異、低毒、周期短、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白表達(dá)上游的mRNA，是傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)所不能比擬的。本研究針對(duì)β2M mRNA序列，設(shè)計(jì)了3對(duì)β2MsiRNA。Lipofectamine 2000因其轉(zhuǎn)染效率高、安全等特點(diǎn)，目前得到了廣泛應(yīng)用。我們使用Lipofectamine 2000作為載體成功將siRNA安全、完整地轉(zhuǎn)入到BMSCs。通過Western blotting、實(shí)時(shí)定量PCR和激光共聚焦顯微鏡觀察分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的預(yù)分化BMSCs，其β2M的表達(dá)明顯下降，其中以siRNA-3的抑制效果最佳。

那么β2MsiRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)預(yù)分化的BMSCs是否有影響呢？基于這方面的考慮，我們選取轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)和Ⅱ型膠原免疫熒光檢測(cè)蛋白聚糖多聚體及Ⅱ型膠原蛋白的分泌情況，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組無明顯差別。

我們利用RNAi技術(shù)下調(diào)β2M對(duì)體外預(yù)分化為軟骨細(xì)胞的BMSCs的免疫原性進(jìn)行了初步研究。但是，在體內(nèi)特定條件下，在BMSCs分化過程中沉默β2M基因的表達(dá)對(duì)免疫排斥反應(yīng)的抑制效果還有待進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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