陸建紅， 陳國(guó)軍， 董長(zhǎng)林， 郭紹文， 金益軍△

(1武警浙江總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 嘉興 314000； 2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院病理科，上海 200130)

異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)家族借助 NAD 或NADP 作為輔助因子，催化異檸檬酸的氧化脫酸反應(yīng), 生成α-酮戊二酸的酶類(lèi)，同時(shí)分別生成 NADH 或 NADPH[1]。IDH 分為 3個(gè)亞型, 其中 IDH-2 在能量代謝和細(xì)胞氧化損傷反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中 IDH-2 發(fā)生突變。目前 IDH-2 在急性髓細(xì)胞白血病、骨髓增殖性腫瘤、膠質(zhì)瘤[2-3]等疾病中研究較為集中，發(fā)現(xiàn)密碼子 R140 和 R172 的精氨酸被其它氨基酸替代，使細(xì)胞中α-酮戊二酸水平明顯下降、2-羥戊二酸水平增高，但 IDH-2在小細(xì)胞肺癌中作用的研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究利用RNA 干擾技術(shù)抑制人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H446 中IDH-2表達(dá)，探討 IDH-2 在小細(xì)胞肺癌中發(fā)生與發(fā)展的作用，從而為小細(xì)胞肺癌的診斷及治療提供新的靶基因。

材 料 和 方 法

1 材料

人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒 Lipofectamine 2000購(gòu)自 Invitrogen；siRNA由上海吉瑪公司合成；小鼠抗人 IDH-2單抗和小鼠抗人 MAPK p42購(gòu)自Cell Signal；人HRP標(biāo)記的β-actin抗體購(gòu)于上?？党缮锕こ逃邢薰?；總 RNA提取試劑 Trizol和RT-PCR試劑盒 (TaKaRa)；Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 試劑盒購(gòu)于Dojindo；Western blotting試劑盒購(gòu)于Sigma；二氧化碳培養(yǎng)箱 (NU-3500)、倒置熒光顯微鏡 (Olympus)和實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀 (ABI 7500)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液 (含10% 胎牛血清，青霉素1×105U/L，鏈霉素100 mg/L)， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

培養(yǎng)NCI-H446細(xì)胞使其充分貼壁，覆蓋率達(dá)到約60%～70%。IDH-2(BC071828)特異性干擾RNA siRNA-IDH-2和無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA-NC由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，用 Lipofectamine 2000按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后siRNA濃度為250 nmol/L, siRNA 轉(zhuǎn)染率約達(dá)到90%。

3 主要方法

3.1Real-time PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 用Trizol一步抽提法提取細(xì)胞總RNA, 用TaKaRa RT 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR綠色熒光標(biāo)記試劑盒 (TaKaRa) 說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀為ABI 7500。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s后；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。比較閾值法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)。

3.2Western blotting檢測(cè)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞裂解提取蛋白后，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5% 脫脂奶粉室溫下封閉2 h，Ⅰ抗為IDH-2或MAPK p42(1∶1 000)和 HRP標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h。

3.3CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 siRNA-IDH-2 和 siRNA-NC 轉(zhuǎn)染 NCI-H446細(xì)胞后，取1×107cells/L 種入 96 孔培養(yǎng)板中(100μL)，各組6個(gè)平行孔，培養(yǎng)72 h。檢測(cè)時(shí)每孔加入 100 μL CCK-8 混合液(含10 μL CCK-8試劑，90 μL培養(yǎng)液)繼續(xù)孵箱培養(yǎng)2 h，后酶標(biāo)儀 450 nm 測(cè)定吸光度(A)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A-空白對(duì)照A)/(NEG組A-空白對(duì)照A)×100%。

3.4細(xì)胞周期分析 選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 NCI-H446 細(xì)胞，以 4×108/L的細(xì)胞密度接種于 24 孔培養(yǎng)板中，各組3個(gè)平行孔。過(guò)夜后按上述方法轉(zhuǎn)染 siRNA，48 h 后收集細(xì)胞，用 4 ℃ 預(yù)冷 4% 多聚甲醛固定10 min， PBS 洗滌2次后，PI (100 mg/L)37 ℃ 孵育細(xì)胞30 min, 后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) NCI-H446 細(xì)胞以每孔2×105個(gè)鋪于 24 孔板，各組3個(gè)平行孔。過(guò)夜后用 siRNA 轉(zhuǎn)染，8 h 后胰酶消化,用無(wú)血清培養(yǎng)基種于孔徑為8 μm Transwell 孔中，孔底加10% FCS的培養(yǎng)液。48 h 后，用結(jié)晶紫染色，熒光顯微鏡下觀察拍照，并計(jì)算40倍目鏡下細(xì)胞個(gè)數(shù)，以對(duì)照NEG組為 100%，計(jì)算各組遷移率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6動(dòng)物實(shí)驗(yàn) NCI-H446 細(xì)胞鋪于6孔板，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，siRNA(250 nmol/L)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染72 h后，將 siRNA-IDH-2和siRNA-NC 2組細(xì)胞以及未處理的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 NEG 組細(xì)胞一起消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度后，分別于裸鼠背部皮下接種 1×107cells/100 μL，每組10 只，接種后在恒溫、恒濕、新鮮空氣、除塵除菌的無(wú)特殊病原菌(SPF級(jí))飼養(yǎng)室條件下飼養(yǎng)。接種后連續(xù)觀察是否成瘤，成瘤后每周由同一測(cè)量者用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大直徑(a)和最小直徑(b)，按公式V=1/2ab2計(jì)算腫瘤體積。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組樣本的比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 siRNA-IDH-2對(duì) NCI-H446 細(xì)胞中 IDH-2 表達(dá)的影響

通過(guò) real-time PCR和Western blotting分別檢測(cè) IDH-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示,siRNA-IDH-2 能夠有效地沉默小細(xì)胞肺癌 NCI-H446細(xì)胞中IDH-2的表達(dá)，與對(duì)照組和未處理 NEG 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而對(duì)照組和 NEG 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)圖1。

Figure 1. The effect of siRNA-IDH-2 on the expression of IDH-2 at mRNA (A) and protein (B) levels in NCI-H446 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs siRNA-NC or NEG.

2 siRNA-IDH-2 對(duì) NCI-H446 細(xì)胞增殖及細(xì)胞中 MAPK p42蛋白表達(dá)的影響

CCK-8方法檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-IDH-2組細(xì)胞增殖明顯比siRNA-NC和NEG對(duì)照組受到抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，見(jiàn)圖2A。同時(shí) Western blotting結(jié)果顯示,siRNA-IDH-2 組 MAPK p42 蛋白表達(dá)弱于對(duì)照組，見(jiàn)圖2B，說(shuō)明是通過(guò)MAPK信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的。

3 siRNA-IDH-2 對(duì) NCI-H446 細(xì)胞周期的影響

siRNA-IDH-2處理組的 S 期細(xì)胞明顯增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖 2C。

4 siRNA-IDH-2 對(duì) NCI-H446 細(xì)胞遷移能力的影響

與siRNA-NC組和NEG組比較，3 d 后siRNA-IDH-2組有明顯抑制細(xì)胞遷移的作用，見(jiàn)圖3。

5 siRNA-IDH-2對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

siRNA-IDH-2組中裸鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯緩慢，體積明顯小于siRNA-NC組和空白組(P<0.01), 而siRNA-NC組和空白組裸鼠腫瘤體積之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤之首，其中小細(xì)胞肺癌(small-cell lung carcinoma, SCLC)是肺癌中惡性度最高的一種，約占原發(fā)性肺癌的 20%～30%，以高侵襲性及不良預(yù)后為其特征。SCLC 傳統(tǒng)治療以全身化療為主，90% 以上的患者治療后復(fù)發(fā)，5 年生存率僅 1%～3%。SCLC 預(yù)后差，迫切需要發(fā)展新的療法，針對(duì)小細(xì)胞肺癌的基因治療是其防治的一個(gè)方向，其中RNA 干擾[4-5]治療在小細(xì)胞肺癌治療中有更為廣闊的應(yīng)用前景。

Figure 2. The effect of siRNA-IHH-2 on the cell proliferation(A), the protein expression of MAPK p42 (B) and the cell cycle (C) in NCI-H446 cells. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs siRNA-NC or NEG.

IDH在能量代謝、氨基酸和維生素合成中扮演重要角色，而且對(duì)該酶的活性調(diào)節(jié)將直接影響 IDH 或 IDH 底物參與不同的生物途徑、發(fā)揮不同的生物功能。完整的 IDH 活性可保護(hù)細(xì)胞免于氧化應(yīng)激，而突變的 IDH 與異檸檬酸的親和力降低，且突變體催化α-酮戊二酸，最終導(dǎo)致α-酮戊二酸的供應(yīng)減少[6-7]。α-酮戊二酸的減少又可導(dǎo)致促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的厭氧誘導(dǎo)因子水平顯著升高，因而誘發(fā)腫瘤。

Figure 3. The effect of siRNA-IDH-2 on the migration of NCI-H446 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs siRNA-NC or NEG.

Figure 4. The effect of siRNA-IDH-2 on the xenograft tumors in the nude mice.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs siRNA-NC or NEG.

MAPK p42/44是維持細(xì)胞增殖的重要信號(hào)通路，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都有MAPK通路主要蛋白的遺傳性和表遺傳性活化。本研究中通過(guò)siRNA-IDH-2抑制IDH-2表達(dá)，同時(shí)抑制MAPK p42蛋白的表達(dá)，從而說(shuō)明NCI-H446細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制是通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路而產(chǎn)生的。MAPK p42蛋白下調(diào)引起細(xì)胞增殖抑制，細(xì)胞周期阻滯于S期，從而引起細(xì)胞凋亡，達(dá)到良好的抑瘤作用。

目前研究證實(shí)細(xì)胞內(nèi)編碼 NADP 依賴(lài)性 IDH的IDH-1 和IDH-2亞型基因的突變可促進(jìn)腫瘤發(fā)生, 且這2個(gè)基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和星狀細(xì)胞瘤等腦瘤中經(jīng)常發(fā)生突變[8]。以上成果提示，IDH-2可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。在本研究證實(shí)了在NCI-H446細(xì)胞中用siRNA特異沉默IDH-2基因后，能有效抑制NCI-H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和遷移能力，更重要的是在沉默IDH-2基因后能顯著抑制小鼠移植瘤的生長(zhǎng)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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