金 鑫， 黃 華， 丁伯平， 黃幀檜

(皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室及中藥藥理國家三級實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002)

腎臟纖維化是在損傷刺激作用下，腎臟固有細(xì)胞(包括纖維細(xì)胞、系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞等)被大量細(xì)胞外基質(zhì)取代，分泌細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等，破壞腎臟正常結(jié)構(gòu)[1]。它是所有腎臟疾病發(fā)展到慢性腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。研究[2]表明，腎臟中固有細(xì)胞的活化和損傷，引起腎間質(zhì)單核-巨噬細(xì)胞浸潤，進(jìn)而釋放大量生長因子和趨化黏附因子等促纖維化因子，最終導(dǎo)致腎臟纖維化的形成和基質(zhì)蛋白合成增多、沉積。糖尿病的產(chǎn)生和發(fā)展會引起一系列并發(fā)癥，腎臟損傷是其中之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)2010年全球糖尿病腎病患者已達(dá)到2.8億，而且以每年2.2%的速度增長。而血糖水平的降低對延緩糖尿病并發(fā)癥具有重要的作用[3]。

葛根素是從豆科植物野葛根的干燥根中提取的主要有效成分，其化學(xué)名稱為4，7-二羥基-8-β-D葡萄糖異黃酮，屬于異黃酮化合物。葛根素具有降低血糖[4]、血壓與血脂[5]，還能抑制炎癥反應(yīng)，對心肌梗死[6]、糖尿病腎病[7]患者起保護(hù)作用。在高血糖治療方面，葛根素是一種胰島素增敏劑[8]。沙格列汀是一種高效二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4, DPP-4)抑制劑，通過選擇性抑制DPP-4來調(diào)節(jié)血糖[9]，是一類新型降糖藥。研究表明, 沙格列汀可以保護(hù)腎臟[10]。二甲雙胍是雙胍類降血糖藥物[11]，其機(jī)制是通過提高胰島素敏感性而增加外周對葡萄糖的利用。二甲雙胍聯(lián)用沙格列汀治療糖尿病優(yōu)于各自單藥治療，并且對腎臟具有保護(hù)作用[12]。據(jù)此，我們推測葛根素聯(lián)用沙格列汀對糖尿病腎病大鼠腎臟應(yīng)具有保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)旨在探討這2種藥物合用對糖尿病大鼠腎臟纖維化的影響及其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動物、藥品、試劑和儀器

健康雄性Wistar大鼠(n=50)，體質(zhì)量150～180 g，由南京青龍山動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號為SCXK(蘇)2009-0001。大鼠在22～24 ℃、濕度60%～65%環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，每籠1只，每日自由進(jìn)食飲水。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ; Sigma)；葛根素注射液(方明藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；沙格列汀片(中美上海施貴寶制藥有限公司)；二甲雙胍(河北山姆士藥業(yè)有限公司)。糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin 1c, HbA1c)測定試劑盒、大鼠巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)與TNF-α試劑盒、RT-PCR試劑盒均來自合肥安啟生物科技有限公司。

JA5003N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；22R高速低溫離心機(jī)(Beckman Coulter)；ELx800自動酶標(biāo)儀(Bio-TEK)；電熱干燥箱(上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；-20 ℃低溫冰箱(Beckman Coulter)；凝膠成像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；血糖測定儀(臺欣)。

2 方法

2.1動物造模及分組 50只雄性Wistar大鼠，給予飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取8只大鼠作為正常對照組(A組，n=8)，其余大鼠制造2型糖尿病模型[13]，即高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周以后，腹腔1次注射STZ(45 mg/kg)，72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L說明造模成功。將造模成功的39只糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照組(B組，n=8)、葛根素治療組(C組，n=7)、沙格列汀治療組(D組，n=8)、葛根素聯(lián)用沙格列汀治療組(E組，n=8)和二甲雙胍聯(lián)用沙格列汀治療組(F組，n=8)。C組每天給予葛根素注射液80 mg/kg腹腔注射；D組每天給予沙格列汀10 mg/kg灌胃；E組每天給予葛根素注射液40 mg/kg腹腔注射和沙格列汀5 mg/kg灌胃；F組每天給予鹽酸二甲雙胍注射液50 mg/kg和沙格列汀5 mg/kg灌胃。A組和B組每天給予相應(yīng)量的生理鹽水腹腔注射。連續(xù)給藥8周，期間每周測1次體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，每周使用1次血糖儀測量尾靜脈血糖。

2.2樣品采集 給藥8周后禁食12 h測空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)，將實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，立即抽取腹主動脈血，放置干燥管中，使用22R高速低溫離心機(jī)離心，取上清液待測；取雙側(cè)腎臟，經(jīng)生理鹽水反復(fù)灌洗，去除包膜后稱重，放置-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3生化指標(biāo)測定 分離出的血清嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，測定HbA1c。使用ELISA試劑盒測定TNF-α和MIF。

2.4腎臟切片染色 取部分腎臟用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，將各組大鼠腎臟組織石蠟橫斷面連續(xù)切3片，厚度約每片5 μm，切片常規(guī)脫蠟去水。然后嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行HE和Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。以Masson染色結(jié)果為對象，用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進(jìn)行分析，計(jì)算高倍鏡視野中被染成藍(lán)色的纖維組織面積與視野總面積的比值，得到纖維化面積所占比率。再采用Katafuchi等[14]方法半定量分析腎間質(zhì)纖維化程度：無纖維化，0分；纖維化面積所占比率<25%，1分；25%～50%，2分；<50%，3分。

2.5RT-PCR法檢測腎臟組織TNF-α、MIF和CD68 mRNA的變化 進(jìn)行半定量PCR分析，評估腎臟組織TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達(dá)情況。以β-actin作為內(nèi)參照，針對TNF-α、MIF和CD68特異性序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1)。使用RNA提取試劑盒提取RNA，以各組腎臟總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，RT-PCR分析TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達(dá)情況。

表1 引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠體重、腎重及腎重指數(shù)的變化

與A組比較，B組大鼠體重明顯下降(P<0.01)，腎重和腎重系數(shù)明顯上升(P<0.01)。與B組比較，D組大鼠體重增加不明顯(P>0.05), C、E和F組大鼠體重增加(P<0.01或P<0.05)；C、D組大鼠腎重下降不明顯(P>0.05)，E、F組大鼠腎重下降(P<0.05)；C、D、E和F組大鼠腎重系數(shù)下降(P<0.01或P<0.05)。與C、D兩組單用藥比較，葛根素聯(lián)用沙格列汀組在增加體重和降低腎重、腎重系數(shù)方面更明顯，見表2。

表2 各組大鼠體重、腎重及腎重指數(shù)

2 葛根素聯(lián)用沙格列汀對大鼠血糖和HbA1c的影響

與A組比較，B組大鼠血糖和HbA1c明顯升高(P<0.01)。與B組比較，各治療組的血糖和HbA1c都有不同程度的下降(P<0.01或P<0.05)。葛根素聯(lián)用沙格列汀可以有效降低血糖和HbA1c，比單用葛根素效果更好，但與沙格列汀聯(lián)用二甲雙胍組之間無顯著差異，見表3。

表3 各組大鼠血糖和HbA1c

3 葛根素聯(lián)用沙格列汀對大鼠血清中TNF-α和MIF的影響

與A組比較， B組大鼠血清中TNF-α和MIF水平都明顯上升(P<0.01)。與B組比較，各治療組大鼠血清中TNF-α和MIF水平下降(P<0.01或P<0.05)。與單給藥組比較，葛根素聯(lián)用沙格列汀降低TNF-α和MIF在血清中的含量更為明顯。與二甲雙胍聯(lián)用沙格列汀治療組相比，葛根素聯(lián)用沙格列汀有進(jìn)一步降低TNF-α和MIF含量的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 各組大鼠血清中TNF-α和MIF的含量

4 各組大鼠腎組織的病理學(xué)觀察

顯微鏡下，HE染色顯示， A組大鼠腎小球體積正常，系膜細(xì)胞無增生。B組大鼠腎小球體積增大，腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞數(shù)增多，腎小管出現(xiàn)明顯空泡和腫脹。各治療組腎組織病理變化與B組比較均發(fā)生不同程度的減輕，葛根素聯(lián)用沙格列汀與單用藥物組比較，改善作用更加明顯。Masson染色結(jié)果顯示，A組大鼠腎間質(zhì)未觀察到明顯的膠原纖維，腎小球、腎小管基底膜染成藍(lán)色，染色較淺。B組大鼠腎間質(zhì)中有明顯的膠原纖維，基質(zhì)增多，染色加深。與B組比較，各治療組纖維化均有不同程度改善，其中，聯(lián)合用藥組較單用藥組改善程度更加明顯。半定量分析表明，B組腎間質(zhì)纖維化積分值明顯高于A組(P<0.01)；與B組比較，各治療組積分值降低(P<0.05或P<0.01)。相比于單用藥，聯(lián)合用藥改善程度更加明顯，但2個(gè)聯(lián)合用藥組之間差異不明顯，見圖1、表4。

Figure 1. Renal tissue with HE and Masson staining in all groups. A: normal control group; B: diabetic model group; C: puerarin treatment group; D: saxagliptin treatment group; E: puerarin combined with saxagliptin treatment group; F: metformin combined saxagliptin treatment group.

5 葛根素聯(lián)用沙格列汀對腎臟TNF-α、MIF及CD68 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與A組大鼠相比，B組大鼠腎臟中TNF-α、MIF及CD68 mRNA都具有較高的表達(dá)。與B組大鼠相比，各治療組大鼠TNF-α、MIF及CD68 mRNA表達(dá)均下降。與單用藥組大鼠比較，葛根素聯(lián)用沙格列汀組大鼠TNF-α、MIF及CD68 mRNA表達(dá)下降更顯著，見圖2。

Figure 2. The mRNA expression of CD68, MIF and TNF-α in the kidneys of all groups. A: normal control group; B: diabetic model group; C: puerarin treatment group; D: saxagliptin treatment group; E: puerarin combined with saxagliptin treatment group; F: metformin combined with saxagliptin treatment group.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs A; #P<0.05 vs B.

討 論

糖尿病腎病是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，也是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭的主要原因之一。腎臟肥大是糖尿病腎病早期病理變化的主要表現(xiàn)[2]，到晚期時(shí)發(fā)展為腎小球硬化、腎小管萎縮以及腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。腎間質(zhì)纖維化是幾乎所有原發(fā)性和繼發(fā)性腎病發(fā)展到終晚期腎衰竭的共同途徑。因此，防止和緩解糖尿病腎病發(fā)生與發(fā)展，尋求有效控制糖尿病腎臟纖維化的藥物成為研究重點(diǎn)。

TNF-α是引起腎臟損傷的重要因子之一，是與腎臟纖維化聯(lián)系最密切的炎癥因子。TNF-α是單核巨噬細(xì)胞等分泌產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，它導(dǎo)致糖尿病腎病的生物學(xué)特性有：(1) 刺激系膜細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基、前列腺素、白三烯等炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致微血管損傷從而引起腎臟纖維化的發(fā)生[15]；(2) 間接刺激巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)其釋放部分細(xì)胞炎癥介質(zhì)；(3) 抑制胰島素信號傳遞，引起胰島素抵抗[16]。這些變化都能夠?qū)е履I臟纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

巨噬細(xì)胞是一種炎癥細(xì)胞，它在腎組織部位聚集、浸潤，能夠分泌各種炎癥因子，如TNF-α和IL-1，加劇炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化[17]。MIF也是巨噬細(xì)胞釋放的一種炎癥細(xì)胞因子，并且能夠反作用于巨噬細(xì)胞，抑制巨噬細(xì)胞的移動，使其固定在腎組織炎癥部位，促使其增殖、釋放更多的TNF-α 等炎癥趨化因子。因此，在腎組織MIF增多的區(qū)域會發(fā)現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞的堆積，進(jìn)而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化[18]。

本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂+STZ誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型，選用天然藥物葛根素與沙格列汀聯(lián)用。本研究顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠血清中MIF與TNF-α的含量顯著升高，腎臟中TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達(dá)顯著升高。據(jù)此推測，TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達(dá)在糖尿病大鼠腎臟中的上升可能是糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制之一，這也與相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)的糖尿病腎病形成的分子機(jī)制相同[2]。沙格列汀是一種高效DPP-4抑制劑，通過選擇性抑制DPP-4來調(diào)節(jié)血糖，是一類新的降糖藥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙格列汀降低血糖與HbA1c，這與Auqeri等[19]報(bào)道的結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，沙格列汀可降低血清中的MIF和TNF-α含量，下調(diào)腎臟中的TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達(dá)。當(dāng)葛根素聯(lián)用沙格列汀時(shí)，以上指標(biāo)下降的程度更加明顯。

總之，葛根素聯(lián)用沙格列汀對糖尿病大鼠腎臟纖維化具有改善作用，其機(jī)制可能與降低血糖、下調(diào)腎臟中TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達(dá)有關(guān)。

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