姜 慧， 劉繼剛，繆雪陽，申旭波，周希雷，鄒 焰

(1.中國疾病預(yù)防控制中心 傳染病預(yù)防控制處，北京 102206； 2.遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院， 貴州 遵義 563000； 3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563099； 4.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563099)

錳是人類在工業(yè)和日常生活中廣泛接觸的一種金屬，目前被認(rèn)為是可能必需的人體微量元素，但攝入過量錳會造成全身多器官的危害，對大腦神經(jīng)系統(tǒng)損傷最為嚴(yán)重，會造成神經(jīng)系統(tǒng)永久性損失，甚至還會致癌、致畸、致突變[1-2]。據(jù)報道，過量錳會導(dǎo)致DNA鏈的斷裂，鏈間的交叉連接出現(xiàn)錯誤、DNA的合成抑制和非程序性DNA修復(fù)合成等DNA損傷的現(xiàn)象[3-5]，引起細(xì)胞及機(jī)體的異常改變。X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(X-ray repair cross complementing group, XRCC1)是一種重要的DNA堿基切除修復(fù)基因，在DNA損傷修復(fù)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6-7]。據(jù)鄭玉新等[8]報道，在同樣的作業(yè)環(huán)境、同樣接觸水平的工人中，并不是所有的接觸者都發(fā)生相關(guān)損害，而僅有部分人發(fā)生，提示個體對錳損傷的敏感性和耐受性是有差異的。XRCC1作為DNA損傷修復(fù)基因，其多態(tài)性與錳接觸者的神經(jīng)行為改變是否有關(guān)，目前尚未有報道。該研究主要探討XRCC1基因的各種多態(tài)與暴露于錳的工人神經(jīng)行為改變的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 研究人群包括200名工齡在半年以上的貴州省錳鐵合金廠冶煉工人，以及94名具相似勞動強(qiáng)度但環(huán)境中無錳暴露的貴州省硅鐵合金廠工人。根據(jù)各工種作業(yè)場所空氣錳濃度和工人接觸錳作業(yè)的工齡，計(jì)算各研究者的累積暴露指數(shù)(Cumulative exposure index, CEI)，CEI=C×T , C是指工作場所平均空氣錳濃度(mg/m3) , T是在C錳濃度下的作業(yè)工齡年。根據(jù)CEI將全部研究人群分為三組：高錳暴露組(CEI>0.4)；低錳暴露組(0.03

1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑、PCR擴(kuò)增試劑(天根生化科技北京有限公司)；限制性內(nèi)切酶MspI(MBI公司，美國)；PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司，美國)；便攜式個體空氣采樣器(SKC Inc，729861，美國)；空氣采樣流量校正儀(SENSIDYNE Inc，0501066-s，美國)；1.000 g/L錳溶液標(biāo)準(zhǔn)品(上海計(jì)量測試技術(shù)研究院)；火焰原子吸收儀(Varian，AA240FS，美國)；溝槽穩(wěn)定試驗(yàn)測量儀(32010，美國普度大學(xué))[9]；插板試驗(yàn)測量儀(32020，美國普度大學(xué))[10]。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 研究人群佩戴空氣個體采樣器采集8 h工作場所的空氣樣本，采樣器的濾膜孔徑是PM2.50。同時采集其外周靜脈血5 mL，肝素抗凝。

1.3.2 樣品錳測定 先將空氣樣品用高氯酸和硝酸混合液(1∶9)消化至無色透明，置于電熱板上蒸干，再用1%硝酸定容至10 mL，上石墨爐火焰原子吸收儀測定空氣中錳濃度。

1.3.3 XRCC1基因多態(tài)性分析 DNA提取采用常規(guī)酚—氯仿法，基因多態(tài)性分析采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法。人XRCC1基因DNA序列及C26304T位點(diǎn)信息從NCBI基因庫獲取，引物采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，上游引物序列為5’-GCCCCGTCCCAGGTA-3’，下游引物序列為5'-AGCCCCAAGACCCTTTCACT-3’(上海捷瑞生物工程公司合成)。PCR反應(yīng)體系是25 μL，ddH2O加入15.7 μL，PCR MasterMix加入 5.8μL，上下游引物各加入1 μL，DNA模板加入1.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃5 min；變性95 ℃1 min，退火58 ℃50 s，延伸72 ℃50 s，共35個循環(huán)；最后延伸72 ℃10 min。酶切體系是20 μL，ddH2O加入11 μL，10×buffer加入2 μL，內(nèi)切酶MspI加入10U，PCR產(chǎn)物加入6 μL，混勻后溫浴37 ℃3.5 h,然后水浴65 ℃15 min,使酶失活，酶切產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照并判讀基因型。

1.4 神經(jīng)行為檢測

1.4.1 溝槽穩(wěn)定試驗(yàn) 將溝槽穩(wěn)定試驗(yàn)測量儀放于被檢測者中央，然后進(jìn)行劃痕長度和碰撞次數(shù)測定，被檢測者測試時不用任何方法支撐手或前臂，將測試筆由溝槽的最寬處向最窄處移動，檢測2次，讀取被檢測者第1次碰觸壁緣時的劃痕長度,將2次劃痕長度取其平均值；另計(jì)數(shù)從最寬處劃到27 cm處時碰撞邊緣次數(shù)， 取2次平均值。反映被試者眼手協(xié)調(diào)性和手穩(wěn)定性。

1.4.2 插板試驗(yàn) 插板試驗(yàn)反映手臂、手和手指整體運(yùn)動協(xié)調(diào)性以及手指尖的靈巧性，是一個組合操作，器械包括1根針、2個墊圈、1個環(huán)。將試驗(yàn)測試板放于被檢測者前面，組合順序是利手將針插入孔中，非利手再套1個墊圈在針上，利手又將1個環(huán)放在墊圈上，非利手再將另1個墊圈放在環(huán)上。針和空心環(huán)放在利手的一側(cè)，圈墊放在非利手的一側(cè)，練習(xí)2次后進(jìn)行正式測試，測試時間60 s，記錄完成組合數(shù)量。每完成1個組合計(jì)為4分，未完成的組合按完成的部分加分，完成一個部分增加1分，計(jì)算總分。

2 結(jié)果

2.1 錳累積暴露指數(shù) 錳高暴露組研究人群的CEI為1.710±0.8438，錳低暴露組研究人群CEI為0.165±0.0974，對照組研究人群CEI為0.014±0.0088。

2.2 XRCC1 C26304T位點(diǎn)電泳結(jié)果 C26304T位點(diǎn)經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物長度為491bp(見圖1),由C→T突變使第194位密碼子由精氨酸(Arg)變?yōu)樯彼?Trp)，從而形成Arg194Trp多態(tài)性，MspI酶切后可出現(xiàn)313bp、292bp、178bp和21bp四個片段，其中野生純合型(Arg/Arg)為292bp、178bp和21bp三個片段；突變純合型(Trp/Trp)為313bp和178bp兩個片段；雜合型(Arg/Trp)為313bp、292bp、178bp和21bp四個片段(見圖2)。

注：M: 100bp DNA Ladder; 2,3,6,11: Arg/Arg基因型；1,4,7,10：Arg/Trp基因型; 5,8,9,12: Trp/Trp基因型。圖2 XRCC1 C26304T 位點(diǎn)各基因型酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖象

2.3 神經(jīng)行為檢測改變和基因多態(tài)性的關(guān)系

2.3.1 工人基本情況 三組研究人群的年齡、文化水平、性別之間無差異(P>0.05)，見表1。

2.3.2 神經(jīng)行為檢測結(jié)果 高、低暴露組中的 XRCC1 C26304T 位點(diǎn)各基因型在垂直溝槽穩(wěn)定試驗(yàn)的劃痕長度檢測、碰撞次數(shù)檢測和插板試驗(yàn)得分三指標(biāo)都有差異(P<0.05)，高暴露組的劃痕長度和插板試驗(yàn)得分低于低暴露組，而碰撞次數(shù)多于低暴露組；并且攜帶突變基因型的研究人群其劃痕長度、插板試驗(yàn)得分均低于攜帶野生基因型和雜合基因型的研究人群，碰撞次數(shù)高于野生基因型和雜合基因型(P<0.05)，對照組內(nèi)各基因型無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表1三組研究人群基本情況

組別基因分型例數(shù)(%)年齡(x±s，歲)文化水平(x±s，年)性別(男/女)高暴露組CC34(33．7)34．847±6．0297．870±1．90428/6CT59(58．4)33．833±6．3537．426±3．55350/9TT8(7．9)31．000±8．6928．200±2．5307/1低暴露組CC22(22．2)33．415±7．17210．396±3．46013/9CT62(62．6)36．309±6．94610．181±3．01947/15TT15(15．2)34．167±7．1059．167±4．99711/4對照組CC34(36．2)36．961±5．8277．923±2．01824/10CT53(56．4)36．447±7．6388．277±1．76644/9TT7(7．4)38．900±8．0458．150±2．8156/1

注：CC為純合型，CT為雜合型，TT為突變型。

表2 XRCC1 C26304T位點(diǎn)各基因型與神經(jīng)行為改變的比較

名稱基因分型劃痕長度(cm)碰撞次數(shù)(次)插板試驗(yàn)(分?jǐn)?shù))高暴露組CC25．038±0．387?△1．916±0．307?△32．930±0．742?△ CT21．920±0．352?3．981±0．280?28．550±0．675? TT19．235±0．8235．532±0．65425．049±1．577 低暴露組CC26．203±0．239?△1．658±0．268?△34．216±0．768?△ CT23．096±0．231?3．143±0．249?30．788±0．713? TT20．914±0．7234．995±0．81025．730±2．319 對照組CC26．537±0．4631．969±0．43234．262±1．044 CT25．483±0．3382．543±0．31533．355±0．762 TT25．291±0．4742．947±0．44331．637±1．070

注：*代表CC、CT與TT之間的差異比較，P<0.05;△代表CC子與CT之間的差異比較，P<0.05。

3 討論

XRCC1基因是一種重要的DNA堿基切除修復(fù)基因，定位于人類19號染色體長臂區(qū)(19q13.2-19q13.3)，其基因組大小約33kb，包含17個外顯子，編碼633個氨基酸，相對分子量69.5kD。其編碼的蛋白可直接與DNA修復(fù)機(jī)制中的相關(guān)酶相結(jié)合形成復(fù)合體，在DNA損傷修復(fù)反應(yīng)中主要參與因電離輻射和氧化損傷引起的堿基切除修復(fù)(BER)和單鏈斷裂修復(fù)[2-4 ,6-7]。

據(jù)樊衛(wèi)平等[11]的報道，過量錳進(jìn)入機(jī)體后能作用于DNA和RNA，直接引起它們的損傷。給小鼠腹腔注射低劑量(10mg/kg)氯化錳，DNA鏈斷裂顯著增加，隨著劑量的增加，DNA損傷越嚴(yán)重，提示錳可作為誘變劑造成DNA損傷，其作用機(jī)制可能是高濃度的Mn2+[12]引起的。

鑒于錳中毒晚期表現(xiàn)為不可逆的進(jìn)行性病變，篩選出早期錳損傷者和易感人群是錳毒性研究中所需要的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高、低暴露組中攜帶XRCC1 C26304T位點(diǎn)基因型的工人劃痕長度、碰撞次數(shù)、插板試驗(yàn)之間是有差異的，并且這個位點(diǎn)突變基因型工人的劃痕長度、插板試驗(yàn)得分均低于攜帶野生基因型和雜合基因型的工人，碰撞次數(shù)高于野生型和雜合型。而對照組內(nèi)各基因型無差異，提示暴露在較高錳環(huán)境中，攜帶突變基因型的工人更易發(fā)生錳對神經(jīng)行為的改變，這也可能為鄭玉新等觀察到的職業(yè)性錳接觸者在同樣的作業(yè)環(huán)境中，同等接觸水平的工人僅有一部分人才發(fā)生錳損傷[8]的現(xiàn)象提供了一定的解釋依據(jù)。這也為將來進(jìn)一步追蹤研究不同XRCC1位點(diǎn)基因型接觸工人的錳損害提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

XRCC1基因不僅與錳所致神經(jīng)損害有關(guān)，還與其它一些慢性病如慢性阻塞性肺炎、肺癌、喉癌等的發(fā)生有關(guān)[13-16]，這也提示我們以后的研究還可擴(kuò)大范圍，觀察其與錳對相關(guān)疾病的影響。

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