明 鈺，熊承良

(1.武漢輕工大學 醫(yī)學技術與護理學院，湖北 武漢 430023;2.華中科技大學同濟醫(yī)學院 計劃生育研究所，湖北 武漢 430022)

目前，對于Atrn生理作用和生化功能的研究主要聚焦于免疫應答，毛發(fā)色素形成，能量代謝，髓鞘形成[1-4]等方面。近10年來，我們通過研究發(fā)現(xiàn)，Atrn在大鼠睪丸間質和精曲小管中均有分布，在Leydig細胞的表達明顯強于睪丸生精細胞[5]。而且，純合子Atrn無效突變小鼠外周血生殖激素也發(fā)生改變[6]。本實驗擬用hCG刺激體外培養(yǎng)Leydig細胞，觀察其合成分泌睪酮的能力，同時檢測AtrnmRNA和Atrn蛋白在此過程中的表達變化，以探討Atrn在Leydig細胞中的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 10～12周齡雄性BALB/c 小鼠，體重23～28 g，購于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心。

1.2 實驗試劑 Ⅰ型膠原酶(Sigma), DMEM/F12(Gibco), Percoll(Amersham pharmacia biotech)， Trizol(Invitrogen)，3%～8%NuPAGE?Novex Tris-Acetate Gels(Invitrogen)，睪酮檢測試劑盒(Cayman)，兔抗Atrn多克隆抗體由斯坦福大學醫(yī)學院遺傳研究室Dr.G.S.Barsh和沈士亮博士惠贈。

1.3 實驗方法

1.3.1 Leydig細胞的分離和培養(yǎng) 小鼠斷頸處死，取出雙側睪丸，剝除被膜、剔除血管，放入含膠原酶的睪丸組織消化液中，37 ℃振蕩消化10～12 min(100 rpm/min)。200目篩網過濾，濾液離心后棄上清。細胞沉淀用DMEM/F12培養(yǎng)液重懸混勻，接種于細胞培養(yǎng)瓶，37 ℃培養(yǎng)1 h。吸出細胞懸液，緩慢加于梯度Percoll之上 (試管底部向上依次為70% 、58% 、30% 、10% Percoll液各2 mL)，4 ℃800 g離心30 min。收集第3細胞帶，PBS洗2次，將細胞密度調至5×105個/mL，接種于6孔培養(yǎng)板。34 ℃培養(yǎng)24 h，經3β-HSD染色鑒定純度在90%以上時用于實驗。

1.3.2 睪酮檢測 更換分別含有0，0.1，1，10，100 ng/mL hCG的無血清培養(yǎng)液，34℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸取上清，1500×g離心10 min，用于測定睪酮分泌量。

1.3.3 實時熒光定量RT-PCR檢測Leydig細胞AtrnmRNA表達 用Trizol提取細胞總RNA，按試劑盒說明書進行RT反應。Atrn上游引物5'-CTCCTGGTCAGTCAAGGTCTC-3，下游引物5'-TCCTGCCCCAGTATCAAATGC-3'，PCR產物長度154bp；β-Actin上游引物5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3'，下游引物5'- TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'，PCR產物長度385bp。反應條件為：95 ℃ 10 min(預變性)后進入循環(huán)(40個)：95 ℃ 變性 25 s；60 ℃ 退火30 s；72 ℃ 延伸30 s；82 ℃ 8 s采集熒光。PCR結束后，以每秒0.2 ℃的速度(從60～95 ℃升高溫度)連續(xù)熒光測量做解鏈曲線。各處理組Leydig細胞AtrnmRNA的量是以其β-ActinmRNA 為內參標準化的相對量。

1.3.4 Western Blot檢測Leydig細胞Atrn蛋白表達 Leydig細胞用RIPA裂解液提取。BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。3%～8%NuPAGE?Novex Tris-Acetate Gels電泳分離蛋白，XCell IITMBlot Module轉移蛋白至PVDF膜(30 V，1 h)。封閉后，加一抗(工作濃度1∶1000)，洗膜后加入二抗。用化學發(fā)光試劑盒顯示反應條帶。Atrn蛋白的相對含量以其膠片上條帶光密度與同一泳道中β-Actin蛋白條帶光密度的比值表示。

2 結果

2.1 hCG對Leydig細胞睪酮生成量的影響 體外原代培養(yǎng)的小鼠Leydig細胞對hCG的刺激有較好的反應性。刺激24 h后，與0 ng/mL hCG劑量組相比較，0.1，1，10，100 ng/mL hCG劑量組睪酮生成量都明顯增加，統(tǒng)計學差異較大(P<0.01)，且這種反應表現(xiàn)為劑量依賴性。當hCG刺激濃度大于10 ng/mL時，Leydig細胞睪酮生成量的增加速度趨于平緩(見表1，圖1)。

hCG(ng/mL)T(ng/mL)AtrnmRNA/β-ActinmRNAAtrn蛋白/β-Actin蛋白015．1±3．48 0．000707±0．000113 0．043774±0．003219 0．198．21±21．06??0．001135±0．00011? 0．07763±0．013551??1153．75±17．64??0．001821±0．00019??0．129672±0．018782?? 10200．39±12．32??0．002179±0．000375??0．159446±0．019441?? 100 213．87±29．73??0．002362±0．000361??0．171152±0．022085??

注：與0ng/mL hCG劑量組相比*P<0.05，**P<0.01。

注：Leydig細胞在不同劑量hCG刺激下合成分泌睪酮的量增加，且表現(xiàn)為劑量依賴性(與0 ng/mL hCG組相比較，**P<0.01)。圖1 hCG對小鼠Leydig細胞睪酮生成量的影響

2.2 hCG對Leydig細胞AtrnmRNA表達的影響 表1和圖2顯示，0.1，1，10，100 ng/mL hCG刺激后，Leydig細胞AtrnmRNA表達量增加(0.1 ng/mL hCG組P<0.05 , 其余劑量組P<0.01)，且這種反應表現(xiàn)為劑量依賴性。

注：Leydig細胞在不同劑量hCG刺激下，Atrn mRNA表達量增加，且表現(xiàn)為劑量依賴性(與0 ng/mL hCG組相比較，* P<0.05 ,**P<0.01)。圖2 hCG對小鼠Leydig細胞Atrn mRNA表達的影響

2.3 hCG對Leydig細胞Atrn蛋白表達的影響 Western blot檢測結果(見表1，圖3，4)顯示，對蛋白條帶進行光密度定量分析，0.1，1，10，100 ng/mL hCG刺激后，Leydig細胞Atrn蛋白表達量均增加(P<0.01)，且這種反應表現(xiàn)為劑量依賴性(見圖4)。

注：Atrn蛋白：160KD；β-Actin蛋白：40KD。圖3 各劑量組Leydig細胞Western blot電泳結果

注：Leydig細胞在不同劑量hCG刺激下，Atrn蛋白表達量增加，且表現(xiàn)為劑量依賴性(與0 ng/mL hCG組相比較，**P< 0.01)。圖4 hCG對小鼠Leydig細胞Atrn蛋白表達的影響

2.4 hCG調節(jié)原代培養(yǎng)小鼠睪丸Leydig細胞AtrnmRNA和Atrn蛋白表達量與睪酮生成量的相關分析 相關分析結果顯示，原代培養(yǎng)小鼠睪丸Leydig細胞給予不同劑量hCG，睪酮生成量與Atrn蛋白表達量(r= 0.987，P<0.01)和AtrnmRNA表達量(r= 0.982，P<0.01)呈正相關。

3 討論

小鼠Atrn基因位于2號染色體，73.9 cM區(qū)，包含29個外顯子，其mRNA約為9 kb，編碼1 428個氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白[7]。AtrnmRNA 分布廣泛，它主要高表達于黑色素細胞、皮膚和中樞神經系統(tǒng)，包括腦、心臟、腎、肝、肺、胃和睪丸[5,7-8]。在下丘腦弓狀核、內側視前區(qū)、視上核、室旁核等GnRH神經元分布的部位，同時檢測到Atrn表達[9- 10]，提示Atrn可能參與調節(jié)下丘腦、垂體、睪丸的功能。

Leydig細胞存在于睪丸間質組織，是體內雄激素的主要來源。雄激素在誘導雄性性別分化，促進性成熟，維持生殖能力和雄性特征等方面起著重要作用。Leydig細胞合成分泌雄激素的功能除了受到下丘腦和垂體調控外，還受到睪丸局部細胞分泌因子的旁分泌調節(jié)。垂體分泌的LH與睪丸Leydig細胞膜受體結合后，激活腺苷酸環(huán)化酶，形成環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，cAMP再激活相應的蛋白酶，使底物磷酸化，產生一系列生物學效應，使Leydig細胞以膽固醇為原料合成和分泌睪酮。通過免疫電鏡進行Atrn蛋白的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)Atrn表達于神經元的細胞膜，神經元和神經膠質細胞的高爾基體膜、內質網膜、線粒體膜上[9-10]。而線粒體和滑面內質網正是Leydig細胞進行合成睪酮過程的主要場所。

本實驗結果顯示，原代培養(yǎng)的Leydig細胞在hCG刺激下，睪酮生成量、AtrnmRNA和Atrn 蛋白表達量都呈現(xiàn)hCG劑量依賴性的增加，并且睪酮生成量無論是與Atrn蛋白表達量還是和AtrnmRNA表達量都呈正相關。由此我們推測Atrn可能與hCG刺激的睪酮合成分泌存在著聯(lián)系。但是，本實驗尚無法說明是hCG刺激睪酮產生后引起Atrn表達增加，還是Atrn參與了hCG刺激的睪酮合成分泌過程，這有待進一步的研究。

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