朱 蓉，趙 逵，方興國，狄連君，陳小燕

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 貴州 遵義 563099)

Achaete scute-like 2 (Ascl2)是一個與腸干細胞相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，是Wnt信號途徑的靶分子之一[1]，目前研究發(fā)現(xiàn)，Ascl2不僅控制成體腸干細胞的“命運”[2]：在小鼠腸上皮中轉(zhuǎn)基因過表達Ascl2出現(xiàn)腸隱窩過度增生和腸絨毛異位隱窩出現(xiàn)，在成體小鼠腸道誘導(dǎo)Ascl2基因表達缺失導(dǎo)致Lgr5陽性的成體腸隱窩干細胞在數(shù)天后消失；而且，Ascl2還與結(jié)腸癌相關(guān)，其調(diào)控結(jié)腸癌干細胞“干性”[3-4]。本研究通過成功構(gòu)建Ascl2的RNAi質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HT-29細胞，通過G418篩選、挑取克隆并擴增培養(yǎng)形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，再將該細胞移植到裸鼠皮下，并采用小動物活體成像儀觀察Ascl2干擾前后HT-29細胞的致瘤能力，以探討Ascl2-RNAi對結(jié)腸癌HT-29細胞體內(nèi)生長增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人結(jié)腸癌HT-29細胞株購自中科院上海細胞庫(該細胞株引自ATCC)； 胎牛血清購自Hyclone公司；Macoy’s 5A培養(yǎng)基購自Sigma公司； LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；抗Ascl2單克隆抗體購自Millipore公司；激光共聚焦掃描顯微鏡購自德國 Carl Zeiss公司；流式細胞儀購自美國BD 公司；小動物活體成像儀Maestro EX2.10(第三軍醫(yī)大學(xué)燒傷研究所)購自美國CRI。

1.2 細胞培養(yǎng)、質(zhì)粒構(gòu)建以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立

1.2.1 細胞的傳代培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細胞株HT-29培養(yǎng)于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A完全培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，每2～3天換液1次，細胞生長融合至70%～80%，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液進行消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與測序 對照質(zhì)粒shRNA-control/EGFP以及shRNA-Ascl2/EGFP質(zhì)粒均由武漢市晶賽生物工程有限公司合成，經(jīng)文獻查得Ascl2干擾片段的序列為CCGCGTGAAGCTGGTGAAC[2 ]，由此設(shè)計合成的DNA模板引物為：

5’-CACCGCCGCGTGAAGCTGGTGAACTTCAAGACGGTTCACCAGCTTCACGCGGTTTTTTG-3',

5’-AGCTCAAAAAACCGCGTGAAGCTGGTGAACCGTCTTGAAGTTCACCAGCTTCACGCGGC-3'.

將合成的片段進行測序驗證，結(jié)果表明構(gòu)建的Ascl2干擾質(zhì)粒目的片段與預(yù)期序列完全相符。

1.2.3 Ascl2-RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT-29細胞 取對數(shù)生長期的HT-29細胞接種于24孔板中，細胞生長至50%～60%融合時，按LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，將2 μL shRNA-Ascl2/EGFP質(zhì)粒溶液加入到37 ℃預(yù)熱的無血清無雙抗培養(yǎng)基48 μL，共50 μL，室溫孵育5 min；將2 μL LipofectamineTM2000試劑加入到37 ℃預(yù)熱的無血清無雙抗培養(yǎng)基48 μL，共50 μL，室溫孵育5 min；將2種溶液輕輕混勻，室溫孵育20 min，加入24孔板中，100 μL/孔，輕輕搖動孔板混勻，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后采用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光的表達情況。

1.2.4 G418抗性篩選，克隆挑取及擴增培養(yǎng) HT-29細胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入篩選濃度的G418篩選培養(yǎng)基(G418篩選濃度為800 μg/mL)，每隔3～5 d換液1次。當(dāng)非熒光細胞幾乎被完全殺死時，降低G418濃度，采用維持濃度(G418維持濃度為400 μg/mL) 維持細胞的篩選。3～4周后可見培養(yǎng)板底有細胞克隆形成，進一步采用激光共聚焦顯微鏡觀察所形成的細胞克隆綠色熒光的表達情況，并作好標記，將標記好的陽性克隆用100 μL槍頭進行挑取，移至加有1 mL完全培養(yǎng)液的24孔板中，加入維持濃度的G418，繼續(xù)培養(yǎng)，激光共聚焦鏡觀察培養(yǎng)的細胞綠色熒光表達情況，繼續(xù)擴增，消化、傳代培養(yǎng)，凍存，分別建立shRNA-Ascl2/HT-29和shRNA-control/HT-29兩個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。

1.3 流式細胞儀檢測GFP陽性細胞比例 常規(guī)消化、離心細胞，用流式緩沖液混懸細胞為單細胞懸液，進行流式細胞儀檢測，以未轉(zhuǎn)染的細胞作為GFP陰性對照。

1.4 western-blot檢測Ascl2的干擾效果 裂解細胞、收集蛋白質(zhì)標本，配膠、上樣、垂直電泳，制作“三文治”結(jié)構(gòu)、電轉(zhuǎn)，封閉、洗膜，加一抗(抗Ascl2單克隆抗體 1:1000)，洗膜、加二抗，曝光(根據(jù)效果調(diào)整時間)，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.5 小動物活體成像儀觀察Ascl2-RNAi對HT-29細胞裸鼠移植瘤生長的影響 4～6周齡的BALB/c裸鼠6只用于成瘤實驗。常規(guī)消化、離心細胞，用生理鹽水混懸細胞為單細胞懸液，計數(shù)板反復(fù)多次計數(shù)后，以1×106細胞(體積：100 μL)接種于裸鼠的背部皮下，左右均接種1×106細胞，左側(cè)為干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞，右側(cè)為對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞。每日觀察裸鼠的狀態(tài)、瘤子的生長狀況，并記錄瘤子的長、短徑。第20天時，對裸鼠進行麻醉、小動物活體成像儀觀察拍照，處死裸鼠，解剖出瘤子后測量大小、稱取重量，并做好記錄。

2 結(jié)果

2.1 激光共聚焦顯微鏡觀察Ascl2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HT-29細胞 激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，Ascl2對照和干擾質(zhì)粒(shRNA-control/EGFP和shRNA-Ascl2/EGFP)轉(zhuǎn)染HT-29細胞48 h(見圖1 A～C)，其轉(zhuǎn)染效率均低于20%，進行G418篩選3～4周后，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆(見圖1 D～F)，進一步消化、傳代，擴增培養(yǎng)(見圖1 G～I)，分別建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細胞系，并命名為shRNA-Ctr/HT-29(shRNA-control/HT-29)和shRNA-Ascl2/HT-29細胞。

注：A～C為瞬時轉(zhuǎn)染48 h,D～F為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆,G～I為擴增培養(yǎng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。圖1 Ascl2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT-29細胞情況

2.2 流式細胞儀檢測GFP陽性HT-29細胞比例 流式細胞儀檢測結(jié)果表明，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、經(jīng)G418篩選出來的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆經(jīng)傳代、擴增培養(yǎng)，檢測GFP陽性細胞比例達90%以上(見圖2 )。

注：A：陰性對照細胞GFP陽性比例；B:Ascl2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞GFP陽性比例。圖2 流式細胞儀檢測GFP陽性細胞比例

2.3 western-blot檢測Ascl2質(zhì)粒的干擾效果 對HT-29、shRNA-Ctr/HT-29和shRNA-Ascl2/HT-29細胞進行Ascl2蛋白質(zhì)表達水平的檢測，western-blot結(jié)果顯示，干擾后細胞中Ascl2蛋白質(zhì)表達明顯下調(diào)(見圖3 )。

注：A為western-blot檢測HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-Ascl2/HT-29細胞中Ascl2蛋白質(zhì)表達條帶，B為蛋白表達統(tǒng)計柱狀圖(**P<0.01 )。圖3 Ascl2干擾效果的檢測

2.4 小動物活體成像觀察Ascl2-RNAi對HT-29細胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用 為了觀察干擾Ascl2對HT-29細胞裸鼠致瘤能力的影響，轉(zhuǎn)染Ascl2干擾質(zhì)粒和對照質(zhì)粒細胞分別以1×106/只注射于裸鼠左側(cè)和右側(cè)背部皮下，每間隔5 d測量1次瘤體積，20 d后，所有的裸鼠均致瘤，麻醉后采用小動物活體成像儀觀察shRNA-Ctr/HT-29和shRNA-Ascl2/HT-29細胞裸鼠皮下致瘤情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ascl2干擾后的HT-29細胞致瘤能力明顯減弱(見圖4A)。脫頸法處死裸鼠，測量瘤體積，取出瘤子稱量瘤質(zhì)量。轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的HT-29細胞所致腫瘤體積和質(zhì)量均小于轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的HT-29細胞所致腫瘤體積和質(zhì)量(見圖4B、C)。

注：A：小動物活體成像儀觀察裸鼠移植瘤的生長情況，左側(cè)：Ascl2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HT-29細胞致瘤，右側(cè)：對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HT-29細胞致瘤；B：裸鼠移植瘤體積生長情況；C：移植瘤質(zhì)量比較柱狀圖(*P<0.05)。圖4 Ascl2-RNAi對HT-29細胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用

3 討論

結(jié)腸癌是人類消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈上升趨勢。中晚期結(jié)腸癌治療困難、療效差，目前盡管強調(diào)綜合性、個體化治療，但終不能解決根本問題。經(jīng)過國內(nèi)外研究者的努力，提出了腫瘤干細胞這一全新的理論，該理論認為腫瘤干細胞才是腫瘤生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。而以腫瘤干細胞為治療靶點，才能從根本上根除腫瘤、防止其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而不僅僅是以減小腫瘤體積為治療目標[5]。Ascl2是一個可能與結(jié)腸癌干細胞“干性”密切相關(guān)的堿性/螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子[4]，深入研究其對結(jié)腸癌生長的影響及機制，可能為將Ascl2作為結(jié)腸癌治療的新靶點提供理論依據(jù)。

本實驗采用RNAi技術(shù)對體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HT-29細胞進行研究，成功構(gòu)建了Ascl2 的RNAi質(zhì)粒，并對HT-29細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染，然后G418篩選，形成穩(wěn)定的克隆后進行挑選并擴增培養(yǎng)形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HT-29細胞系，確定干擾效果后對裸鼠進行皮下移植瘤實驗，采用小動物活體成像技術(shù)觀察移植瘤的熒光表達情況和瘤體生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HT-29細胞經(jīng)Ascl2干擾后，皮下移植瘤的生長能力明顯減弱，說明Ascl2與結(jié)腸癌的生長密切相關(guān)，結(jié)合文獻報道，Ascl2可能成為一個結(jié)腸癌治療的新靶點，且Ascl2表達局限，研究報道其表達僅限于腸道隱窩基底的Lgr5陽性的腸成體干細胞以及胎盤[2]，該轉(zhuǎn)錄因子作為結(jié)腸癌治療的新靶點可能具有靶向性好和副作用小等更多的優(yōu)勢。

小動物活體成像儀能夠直觀的觀察到瘤體綠色熒光表達情況，并可以在整個過程中動態(tài)觀察，可以作為一種很好的研究手段用于活體小動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移研究[6]。小動物活體成像技術(shù)機理是：通過活體腫瘤、細胞或基因的生物發(fā)光以及熒光標記，采用制冷CCD(高靈敏度)配合特制的成像暗箱，再用圖像軟件進行處理，從而直觀觀測活體小動物體內(nèi)腫瘤的生長、遷移、轉(zhuǎn)移擴散，以及細胞活動，甚至可以觀測特定基因的表達，還可通過標記細菌或病毒從而觀測感染性疾病的發(fā)展等生物學(xué)過程[6-7]。該技術(shù)觀察靈敏度高、結(jié)果直觀，可以進行實時觀測、動態(tài)觀察和定量評估，操作簡單、安全，不涉及反(放)射性物質(zhì)，且實驗成本低。因此，目前小動物活體成像技術(shù)在國內(nèi)外得到越來越多的應(yīng)用，也極大地促進了生命科學(xué)特別是腫瘤研究的發(fā)展[8-12]，該技術(shù)值得推廣。

本實驗在整個過程中觀察到綠色熒光表達沒有衰減，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的成功以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有一定的時效性，短時間內(nèi)不會衰減，可以作為一種很好的經(jīng)濟的研究手段，而不是一定要進行慢病毒轉(zhuǎn)染等較高費用的研究。我們作為西部地區(qū)的科研單位，采用這種經(jīng)濟實用的研究手段，爭取能為醫(yī)學(xué)事業(yè)和整個人類的健康做出更大的貢獻。

[參考文獻]

[1] Jubb A M,Chalasani S, Frantz GD, et al. Achaete-scute like 2(ascl2) is a target of Wnt signaling and is upregulated in intestinal neoplasia[J]. Oncogene, 2006,25(24)：3445-3457.

[2] van der Flier L G,van Gijn M E,Hatzis P, et al.Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate[J]. Cell, 2009,136(5):903-912.

[3] Jubb A M, Hoeflich K P, Haverty P M, et al. Ascl2 and 11p15.5 amplification in colorectal cancer[J]. Gut, 2011,60(11):1606-1607.

[4] Rong Zhu, Yongtao Yang, Yin Tian, et al. Ascl2 knockdown results in tumor growth arrest by miRNA-302b-related inhibition of colon cancer progenitor cells[J]. PLoS one, 2012,7(2):e32170.

[5] Clevers H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges[J]. Nat Med, 2011,17(3):313-319.

[6] 朱淼鑫，姚明. 小動物活體成像技術(shù)的應(yīng)用[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志， 2011，21 (3)：1-5.

[7] 李珂，趙光. 小動物活體成像技術(shù)的應(yīng)用進展[J]. 實用醫(yī)藥雜志， 2012，29 (1)：81-82.

[8] 王豫，關(guān)華，宋曼，等. 小動物生物發(fā)光活體成像的條件優(yōu)化與技術(shù)擴展研究[J]. 軍事醫(yī)學(xué)，2013，37 (4)：271-273.

[9] 范臨蘭，席曉霞，魏虎來，等. 應(yīng)用活體成像技術(shù)對三氧化二砷抗小鼠4T1乳腺癌作用的研究[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)， 2013，43(2)：170-176.

[10] 張繪宇， 鄭國兵， 張金棟， 等. 利用熒光素酶標記的腫瘤細胞建立活體成像動物模型[J]. 中國體視學(xué)與圖像分析， 2013，18(1)：67-72.

[11] 倪慶純，韓重，楊威，等.利用小動物活體成像技術(shù)快速評價藥物的抗腫瘤作用研究[J]. 今日藥學(xué)，2012，22 (6)：321-323.

[12] 劉霞，閆美娜，王薈，等. mLumin 轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2 細胞系的建立[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報， 2011，21(4)：322-325.