韓 潔， 楊 慧，杜建穎， 王春妹， 王啟明 ，田德潤

(天津醫(yī)科大學 解剖與組織胚胎學系，天津 300070)

mTOR(mammalian target of rapamycin)，即哺乳動物雷帕霉素靶點，在所有的真核生物中普遍高表達，是調(diào)節(jié)細胞生長的中心，與人類的健康息息相關(guān)，許多慢性疾病的發(fā)生都與mTOR通路信號的改變有關(guān)，如II型糖尿病、肥胖、代謝綜合征以及多種腫瘤性疾病[1-3]。mTOR存在于兩種復(fù)合體中，mTORC1和mTORC2[4]。其中，mTORC1由四個亞基組成，其下游底物包括4E-BP1和S6K等；而mTORC2由五個亞基組成，包括其下游底物包括AKT、PKC等。兩種復(fù)合體中，mTORC1與代謝聯(lián)系緊密[5]，它可以控制細胞生長，血管發(fā)生和代謝等[6- 7]。mTOR通路上游有多種調(diào)節(jié)因素，如：瘦素(leptin)、脂聯(lián)素、胃饑餓素(ghrelin)、膽囊收縮素、胰島素等，這些因素可以在下丘腦和外周器官通過mTOR通路相互影響以調(diào)控機體的能量平衡[8]。下丘腦是機體能量調(diào)節(jié)的中樞，而胰腺作為一個重要的外周器官，對能量平衡和代謝也有重要的影響。我們前期的實驗發(fā)現(xiàn)食源性肥胖(DIO)大鼠下丘腦AMPK表達下調(diào)，導(dǎo)致mTOR通路活性增加。本文旨在比較DIO大鼠和DR大鼠胰腺中mTOR通路的變化，并探討這種變化對整個機體能量和代謝過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 100只剛斷乳雄性SD大鼠，體重40～50 g。動物飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學實驗動物中心，動物室溫度：(22±2)℃；每天光照：7：00～19:00；隨意取食飼料和自來水?；A(chǔ)維持飼料適應(yīng)喂養(yǎng)1周后分組：①高脂飲食組(n=80)，給予自制高脂飲食飼料；②對照組(n=20)，繼續(xù)給予基礎(chǔ)維持飼料。繼續(xù)喂養(yǎng)14周后，高脂飲食組體重超過對照組最大體重者，設(shè)為肥胖組(DIO)；體重低于對照組平均體重的設(shè)為肥胖抵抗組(DR)。

1.2 動物飼料 基礎(chǔ)維持飼料能量成份：5%脂肪，55%碳水化合物，22%蛋白質(zhì)，7%灰分，5%纖維素。飼料熱量為3.80 kcal/g。

自制高能飼料配方為：50%標準動物飼料，15%豬油，10%白糖，5%奶粉，10%雞蛋，5%芝麻油，5%花生。能量成份為：30%脂肪，40%碳水化合物，15.5%蛋白質(zhì)，4%灰分，3%纖維素。飼料熱量為4.76 kcal/g。

1.3 取材 各組動物經(jīng)水合氯醛(500 mg/kg)麻醉后，主動脈插管，用生理鹽水快速灌注沖出血液后，用4%多聚甲醛緩慢灌注，至全身肌肉抽搐后停止。迅速剪開腹腔，取胰腺，放入4 ℃4%多聚甲醛溶液中后固定，過夜。

1.4 包埋及切片 部分組織梯度蔗糖脫水(至組織下沉)后，用OCT膠包埋。冰凍切片厚度：6～8 μm。其余組織蒸餾水沖洗后，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋。石蠟切片厚度：4 μm。

1.5 免疫組織化學和免疫熒光

1.5.1 免疫組織化學 石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，0.3% H2O2甲醇溶液滅活過氧化物酶，98℃檸檬酸鈉修復(fù)抗原，10%山羊血清封閉后，加入一抗(AMPK、4E-BP1)，4℃過夜，再經(jīng)SP試劑盒(二抗和辣根過氧化物酶)，DAB顯色，蘇木素染色，酒精梯度脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。PBS替代一抗作為陰性對照。

1.5.2 免疫熒光 冰凍切片經(jīng)室溫復(fù)溫后水化，經(jīng)1%Triton-X100增加通透性，10%山羊血清封閉后，加入一抗(S6K)，4℃過夜，再避光加入二抗、DAPI，最后用甘油封片。PBS替代一抗作為陰性對照。用倒置熒光顯微鏡(Olympus IX71)觀察并照相；通過比較熒光信號的強弱和熒光細胞的數(shù)量對結(jié)果進行分析。

1.6 圖像分析 針對各組的免疫組化染色結(jié)果，分別選取5個獨立的視野用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量出單位光密度值，并求得平均光密度值(OD值)再進行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 動物模型結(jié)果 初始體重高脂飲食組(49.95±2.56)g，對照組(48.65±2.94)g，兩組無差別。給予不同飼料4周后開始出現(xiàn)差別，持續(xù)到14周。兩組最終體重分別為高脂飲食組(545.98±49.49)g，對照組(497.55±37.38)g，具有顯著差異(P<0.001)(見圖1)。其中，高脂飲食組36只大鼠體重超過對照組最高體重，設(shè)置成DIO組(587.56±39.32)g，11只鼠體重低于對照組平均體重，設(shè)置成DR組(476.90±15.06)g，對照組體重取中間10只，設(shè)置成CO組(503.03±17.24)g。DIO組與DR組、DIO組與CO組之間體重有統(tǒng)計意義(P<0.001)，DR組和CO組之間體重無統(tǒng)計意義(見圖2)。

注：﹡：P<0.05，﹡﹡：P<0.01,﹡﹡﹡:P<0.001,VS對照組。圖1 大鼠體重變化圖

注：﹡﹡﹡:P<0.001,vs DR；﹟﹟﹟：P<0.001,vsCO。圖2 分組后大鼠體重圖

2.2 免疫組織化學和免疫熒光結(jié)果 AMPK在胰腺中的陽性表達以胞漿為主，呈棕黃色顆粒狀；以內(nèi)分泌部細胞表達明顯。DIO組明顯高于DR組，有統(tǒng)計意義(P<0.05)(見表1、圖3)。

表1大鼠胰腺各組免疫組化結(jié)果平均光密度值(OD值)比較

注：﹡：P<0.05，vs DIO。

4E-BP1陽性表達同樣以胞漿為主，呈棕黃色顆粒狀，表達的區(qū)域以胰腺的外分泌部細胞最為明顯，胰島外周部亦有表達，DIO組明顯低于DR組，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1、圖4)。

S6K的免疫熒光陽性表達著色以胞漿為主，呈綠色熒光，胰腺的胰島外周部有典型的綠色熒光信號，DIO組明顯低于DR組(見圖5)。

注： A:DIO胰腺；B:DR胰腺。圖4 4E-BP1免疫組織化學染色SP法×100

注： A:DIO胰腺；B:DR胰腺。圖5 S6K免疫熒光×200

圖6 AMPK/mTOR通路圖

3 討論

肥胖及其相關(guān)性代謝性疾病在世界的流行越來越受到人們的關(guān)注。食源性肥胖大鼠模型的建立過程，模擬了人類肥胖發(fā)生的過程。在建模過程中，原本體重無差異的大鼠，部分表現(xiàn)出攝食過度，成為DIO大鼠，另外的部分則維持了相對正常的體重，成為DR大鼠，這表明肥胖這種疾病的發(fā)生受基因和環(huán)境(如飲食)共同控制，而不是僅受基因或者環(huán)境單方面的影響。

果蠅和哺乳動物基因研究表明TSC1/TSC2是位于mTORC1上游的重要抑制劑，磷酸化TSC1/TSC2可以調(diào)節(jié)mTORC1的活性，缺失TSC1/TSC2會導(dǎo)致mTORC1過度活躍[9]。 AMPK可以磷酸化TSC2保守的絲氨酸位點，抑制mTORC1復(fù)合體的活性[10]。而當缺乏TSC2的細胞時給予AMPK后，細胞仍然可以變現(xiàn)出部分抑制，說明AMPK還可以通過除TSC2之外的其他途徑直接或間接影響mTORC1活性[11]，如AMPK可以通過直接磷酸化raptor(mTORC1復(fù)合體的一個亞基)來抑制mTOR通路的活性[12-13]。

AMPK是一種AMP相關(guān)的高度保守的異源三聚體絲氨酸/蘇氨酸激酶復(fù)合體。AMPK可以作為機體能量的開關(guān)，在能量不足的情況下被激活[9]。當能量不足時，AMP可以直接綁定AMPKγ亞基的CBS區(qū)域，抑制α亞基的絲氨酸的去磷酸化，而這種絲氨酸的磷酸化是AMPK激活所必須的[14]。AMPK可以對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中的激素和營養(yǎng)的信號作出反應(yīng)，進而調(diào)節(jié)食物攝入和能量消耗。其下游靶點mTOR通路，可以作為細胞內(nèi)的營養(yǎng)傳感器來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細胞生長和代謝。

mTOR通路經(jīng)典的下游靶標4E-BP1和S6K都有一個特殊的基序(TOS基序)，可以使二者直接綁定到mTORC1復(fù)合體的raptor上[15]。4E-BP1多個位點磷酸化，使得4E-BP1從eIF4E上解離，并促進eIF4G與eIF4E綁定，最終形成翻譯起始復(fù)合物。同時，S6K1的389位蘇氨酸磷酸化，激活S6K1，隨后磷酸化核糖體蛋白S6，最終促進蛋白質(zhì)的合成。另外，S6K1也可以對準eIF4B的422位絲氨酸，促進其與eIF4A綁定，提高eIF4A解鏈酶活性，然后啟動蛋白質(zhì)翻譯過程[16](見圖6)。

胰腺作為機體重要的內(nèi)分泌器官，分為外分泌部和內(nèi)分泌部。其中內(nèi)分泌部起主要作用的是胰島細胞，包括α細胞、β細胞、D細胞和PP細胞等。α細胞主要位于胰島的外周部分，分泌胰高血糖素；β細胞和D細胞主要位于胰島的中間部分，分別分泌胰島素和生長激素；而PP細胞含量很少，分泌胰多肽。

我們的結(jié)果顯示，DR大鼠胰島的周圍部分4E-BP1和S6K表達增加，也就是mTOR通路活性與DIO相比明顯增加，而其上游AMPK信號卻相對減弱。而位于胰島外周的是胰島α細胞[17]，信號活化增加了胰高血糖素的分泌。胰高血糖素可以激活肝細胞的磷酸化酶，加速糖原分解。也可激活脂肪酶，促進脂肪分解，并且加強脂肪酸氧化，使酮體生成增多。還可以促進氨基酸進入肝細胞。酮體和氨基酸的增加可以促進糖異生，可以與分解的肝糖原共同升高血糖。升高的血糖可以通過下丘腦的AMPK傳遞飽食的營養(yǎng)信號，刺激下丘腦弓狀核分泌抑制食欲的POMC[18]，導(dǎo)致食物的攝入的減少，從而使DR大鼠維持較正常體重。此外，胰高血糖素在肝臟促進脂肪分解，也可以從另一方面維持DR大鼠體重。有文獻報道，胰島α細胞缺失的胰島對葡萄糖刺激產(chǎn)生的胰島素明顯降低[19]，也就是說，胰高血糖素刺激了胰島素的分泌，缺乏其刺激作用將減少胰島素的分泌，這可能是DR大鼠能維持正常體重的又一重要原因。但確切的機制需要進一步的研究證實。

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