蔡翼+李志娟+白明珍+溫小芳+彭麗君+黃真池+

摘要：取８ ｄ苗齡的尾葉桉（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith）幼苗下胚軸作外植體，以ＳＰＣａ為基本培養(yǎng)基，添加Ｎ－苯基－Ｎ－噻唑基脲（ＰＢＵ）、噻苯?。ǎ裕模冢ⅲ叮S基氨基嘌呤（６－ＢＡ）３類細(xì)胞分裂素與ＩＡＡ進(jìn)行組合，研究細(xì)胞分裂素與生長素比值對尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，接種５６ ｄ后，不同濃度ＰＢＵ與ＩＡＡ的組合誘導(dǎo)出直徑大于５ ｍｍ愈傷組織塊的比例高，愈傷組織塊褐化率低，形成的綠色愈傷組織塊的比例高。綠色愈傷組織容易分化出不定芽。說明這３類細(xì)胞分裂素中，ＰＢＵ促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞分裂和分化的能力較強(qiáng)，且能有效減輕褐變。

關(guān)鍵詞：尾葉桉（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith）；愈傷組織誘導(dǎo)；Ｎ－苯基－Ｎ－噻唑基脲（ＰＢＵ）；噻苯?。ǎ裕模冢?；６－芐基氨基嘌呤（６－ＢＡ）

中圖分類號：Ｑ９４５．４５；S79文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）09－2177-04

Ｅｆｆｅｃｔｓ of Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎs on Inducing

Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith Ｃａｌｌｕｓ

ＣＡＩ Ｙｉａ，ＬＩ Ｚｈｉ－ｊｕａｎａ，ＢＡＩ Ｍｉｎｇ－ｚｈｅｎａ，ＷＥＮ Ｘｉａｏ－ｆａｎｇａ，ＰＥＮＧ Ｌｉ－ｊｕｎａ，ＨＵＡＮＧ Ｚｈｅｎ－ｃｈｉａ，ｂ

（ａ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｃｈｏｏｌ；ｂ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｐｌａｎｔ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ ５２４０４８，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ inducing Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith ｃａｌｌｕｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｃｕｌｔｕｒing ｔｈｅ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ ｏｆ ８－ｄａｙ－ｏｌｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｎ ＳＰＣａ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ with Ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＩＡＡ） ｗｅｒｅ Ｎ－ｐｈｅｎｙｌ－Ｎ－［６－（２－ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ）ｙｌ］ ｕｒｅａ（ＰＢＵ）， １－ｐｈｅｎｙｌ－３－（１，２，３－ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ－５－ｙｌ） ｕｒｅａ（ＴＤＺ），６－ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ（６－ＢＡ）． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＢＵ ａｎｄ ＩＡＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃａｌｌｉ ｂｉｇｇｅｒ ｔｈａｎ ５ ｍｍ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ ａｔ ｔｈｅ ５６ｔｈ ｄａｙ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｂｒｏｗｎ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ． Ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｃａｌｌｉ ｗｅｒｅ ｅａｓｙ ｔｏ produce ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ． ＰＢＵ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith ｃａｌｌｕｓ． ＰＢＵ ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith；ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； Ｎ－ｐｈｅｎｙｌ－Ｎ－［６－（２－ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ）ｙｌ］ ｕｒｅａ（ＰＢＵ）；１－ｐｈｅｎｙｌ－３－（１，２，３－ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ－５－ｙｌ） ｕｒｅａ（ＴＤＺ）；６－ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ（６－ＢＡ）

桉樹（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｏｂｕｓｔａ Ｓｍｉｔｈ）原產(chǎn)于澳大利亞，有７００多種，具有速生、豐產(chǎn)、輪伐期短等特點(diǎn)，是優(yōu)良的紙漿用材，經(jīng)濟(jì)效益顯著［１］。桉樹是世界上主要產(chǎn)材樹種之一，其人工造林已占世界人工造林的1/5，是世界上種植面積最大的闊葉樹種。我國是亞洲最大的桉樹種植國［２］。桉樹組織培養(yǎng)是林木組織培養(yǎng)研究最早、最多的一大類。早在１９６５年，Ｓｕｓｓｅｘ通過赤桉實(shí)生苗外植體獲得了其愈傷組織。此后，國內(nèi)外學(xué)者先后利用桉樹木質(zhì)塊莖、節(jié)間、下胚軸、葉、成年桉樹嫩枝段等不同器官組織培養(yǎng)誘導(dǎo)完整植株成功［３］。目前，全世界已對６０種桉樹進(jìn)行了組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，至少３０種桉樹已經(jīng)在離體愈傷培養(yǎng)中取得成功，然而植株成功再生的樹種較少［４］。桉樹作為含酚類和多糖豐富的木本植物，其再生系統(tǒng)的建立難度較大［５］。以桉樹為材料再生成功的報(bào)道中，常用６－芐基氨基嘌呤（６－ＢＡ）、Ｎ－苯基－Ｎ－噻唑基脲（ＰＢＵ）、噻苯?。ǎ裕模冢┑燃?xì)胞分裂素［５－７］進(jìn)行處理。

本試驗(yàn)用８ ｄ苗齡的尾葉桉幼苗下胚軸作為外植體，以ＣａＣｌ２濃度提高到６７９．３２ ｍｇ／Ｌ的改良ＳＰＣａ培養(yǎng)基［６］為基本培養(yǎng)基， 添加不同濃度ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ和ＩＡＡ的激素組合。接種５６ ｄ后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的生長和分化情況，探討適用于尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)的激素組合，分析激素組合和ＣＴＫ／ＩＡＡ比值對愈傷組織分化的影響，旨在為尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)及芽分化提供參考。

１材料與方法

１．１材料

尾葉桉種子，購自國家林業(yè)局桉樹中心。

１．２試劑

Ｎ－苯基－Ｎ－噻唑基脲（ＰＢＵ），由廣東省特色植物工程中心合成并純化；噻苯?。ǎ裕模冢停拢茫龋牛凸井a(chǎn)品；吲哚乙酸（ＩＡＡ）和６－芐基氨基嘌呤（６-ＢＡ）為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

１．３種子消毒

將尾葉桉種子在蒸餾水中浸泡３ ｈ后用７０％的乙醇表面消毒４５ ｓ，用無菌水漂洗４次，清除殘留乙醇。再用２０％的次氯酸鈉溶液消毒８ ｍｉｎ，期間輕輕搖動三角瓶以提高滅菌效果。用無菌水漂洗４次后，再用２０％的次氯酸鈉溶液浸泡８ ｍｉｎ，用無菌水漂洗６次后，將種子播種到ＳＰＣａ培養(yǎng)基上，置于２５ ℃暗處萌發(fā)。

１．４愈傷組織的誘導(dǎo)

取高３～５ ｃｍ、僅含１對子葉、苗齡為８ ｄ的無菌種子幼苗，切取８ ｍｍ長的下胚軸切段為外植體，接種于以ＳＰＣａ為基本培養(yǎng)基，添加０．５７ μｍｏｌ／Ｌ ＩＡＡ（吲哚乙酸）與不同濃度梯度的ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ、ＰＢＵ＋ＴＤＺ、ＴＤＺ＋６－ＢＡ、ＰＢＵ＋６－ＢＡ組合的培養(yǎng)基上（設(shè)ＣＴＫ／ＩＡＡ分別為１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０，共７個(gè)濃度梯度），置于（２５±２） ℃，暗處培養(yǎng)２周。然后轉(zhuǎn)移至１６ ｈ/d光照、５０ μｍｏｌ／（ｍ２·ｓ）光照度、（２５±２） ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)６周，接種５６ ｄ后統(tǒng)計(jì)綠色和褐色愈傷組織的數(shù)量，計(jì)算綠色愈傷組織誘導(dǎo)率和褐化率并拍照。每種不同濃度梯度的激素組合設(shè)３次重復(fù)，每次重復(fù)約３０個(gè)外植體。

endprint

綠色愈傷組織誘導(dǎo)率＝（綠色愈傷組織塊數(shù)／總外植體數(shù)）×１００％

褐化率＝（褐色愈傷組織塊數(shù)／總外植體數(shù)）×１００％

２結(jié)果與分析

２．１種子消毒處理

用２０％次氯酸鈉溶液消毒２次，每次８ ｍｉｎ，播種３ ｄ后種子發(fā)芽率達(dá)１００％。第八天，幼苗長為３～５ ｃｍ，生長健壯，無畸形苗。表明這種方法既能將種子徹底消毒，又不會影響種子萌發(fā)。

２．２不同激素組合對尾葉桉愈傷組織大小的影響

由表１可知，６種激素組合中，ＰＢＵ＋ＩＡＡ組合誘導(dǎo)出直徑大于５ ｍｍ尾葉桉愈傷組織的比例最高，ＰＢＵ／ＩＡＡ的比值為１．０時(shí)，直徑大于５ ｍｍ的愈傷組織比例達(dá)８９％。ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ的激素組合誘導(dǎo)出直徑大于５ ｍｍ愈傷組織的比例最低，（ＴＤＺ＋ＰＢＵ）／ＩＡＡ的比值為３．０時(shí)，直徑大于５ ｍｍ愈傷組織的誘導(dǎo)率僅為１３％，其他比值的ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ組合幾乎不能誘導(dǎo)出直徑大于５ ｍｍ的愈傷組織。前期研究發(fā)現(xiàn)，較大的愈傷組織塊細(xì)胞分裂旺盛，分化潛力較大，不易褐化死亡［６］。

２．３不同激素組合對尾葉桉愈傷組織褐變的影響

由表２可知，６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素組合培養(yǎng)下尾葉桉愈傷組織褐化最為嚴(yán)重，平均褐化率為６３．７％。６－ＢＡ／ＩＡＡ＝４．０時(shí)，尾葉桉愈傷組織褐化率高達(dá)９３％。其他激素組合中尾葉桉愈傷組織平均褐化率差別較小，介于１０．６％與２０．０％之間。比較６個(gè)激素組合的平均褐化率，ＰＢＵ＋ＩＡＡ組合的平均褐化率最低， ６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素組合平均褐化率最高。ＰＢＵ和６－ＢＡ組合使用比單獨(dú)使用６－ＢＡ誘導(dǎo)出的愈傷組織的平均褐化率明顯降低。ＴＤＺ和６－ＢＡ組合使用也能有效防止褐化。但ＰＢＵ＋ＴＤＺ組合使用抑制愈傷組織褐化的效果不明顯。因此，ＰＢＵ既能明顯促進(jìn)尾葉桉愈傷組織塊的分裂和分化，又能減輕褐化。

２．４不同激素組合對尾葉桉愈傷組織分化的影響

尾葉桉外植體接種在含ＩＡＡ與不同濃度梯度的ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ、ＰＢＵ＋ＴＤＺ、ＴＤＺ＋６－ＢＡ、ＰＢＵ＋６－ＢＡ組合的ＳＰＣａ培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第七天尾葉桉愈傷組織從外植體的切割面長出，愈傷組織分化率為１００％。兩周后外植體兩端明顯膨大。５６ ｄ時(shí)，愈傷組織分化成綠色、紅色、白色、黃色、褐色愈傷。

從表３中可以看出，ＰＢＵ＋ＩＡＡ激素組合培養(yǎng)下尾葉桉綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最高，為３４．０％。６－ＢＡ＋ＩＡＡ組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最低，僅為１２.0％。其他幾種激素組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率介于２０．０％和２６．９％之間?？梢姡c６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ誘導(dǎo)胚性細(xì)胞形成和分化的能力更強(qiáng)。

２．５ＰＢＵ誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷及綠色愈傷組織的芽分化

觀察ＰＢＵ誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷組織，其表面濕潤，有光澤，呈淺綠色至深綠色。愈傷組織塊表面有多個(gè)可見顆粒，顆粒內(nèi)可見明顯的芽點(diǎn)（圖１Ａ）。芽點(diǎn)逐漸增大，芽尖突破愈傷表面，芽尖周圍分化出葉片，成為不定芽（圖１Ｂ）。前期研究發(fā)現(xiàn)，桉樹綠色愈傷細(xì)胞代謝旺盛，酶活性高，分化潛力大［５－７］。

３討論

桉樹的組織培養(yǎng)常因外植體啟動分裂難、形成的愈傷組織易褐變壞死、芽分化困難等原因難以成功。６－ＢＡ是人工合成的嘌呤類細(xì)胞分裂素。ＰＢＵ和ＴＤＺ是人工合成的雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素。它們在啟動外植體的細(xì)胞分裂分化和形成胚性愈傷組織中有廣泛的應(yīng)用。本研究分析了ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ和ＩＡＡ的激素組合條件下，尾葉桉愈傷組織的生長、褐化和分化情況，發(fā)現(xiàn)與６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ能明顯促進(jìn)愈傷組織塊的分裂和分化，減輕褐化，促進(jìn)不定芽的分化。

嘌呤類細(xì)胞分裂素６－ＢＡ雖然啟動尾葉桉愈傷組織分裂的能力較強(qiáng)，６－ＢＡ／ＩＡＡ的比值為２．０時(shí)，直徑大于５ ｍｍ愈傷組織的誘導(dǎo)率為３８％，但愈傷組織極易褐變壞死，失去分化能力。ＴＤＺ抑制褐化的效果與ＰＢＵ相近，但誘導(dǎo)形成的綠色愈傷組織誘導(dǎo)率明顯低于ＰＢＵ。

雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素可直接作用于細(xì)胞分裂素受體，引起下游信號網(wǎng)絡(luò)中酶的活化［８］。另外，雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素也可通過阻止細(xì)胞分裂素的降解或抑制細(xì)胞分裂素氧化酶活性減慢細(xì)胞分裂素的分解，從而提高植物細(xì)胞中細(xì)胞分裂素的濃度［９］。脲類細(xì)胞分裂素具有功能多樣、代謝穩(wěn)定、不易被氧化酶氧化、作用濃度低、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)［１０］。其中ＰＢＵ在桉樹的胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生中已顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢［５－７］。ＰＢＵ在桉樹分化和再生領(lǐng)域的獨(dú)特優(yōu)勢將推動桉樹的遺傳轉(zhuǎn)化，促進(jìn)桉樹遺傳改良工作。但ＰＢＵ抑制愈傷組織褐變，促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞分裂分化和不定芽分化的機(jī)理還有待深入研究。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 謝耀堅(jiān)．桉樹組織培養(yǎng)研究進(jìn)展［Ｊ］．世界林業(yè)研究，２０００，１３（６）：１４－１９．

［２］ 祁述雄．中國桉樹［Ｍ］．北京：中國林業(yè)出版社，２００６．

［３］ 歐陽磊．桉樹組培快繁中存在的問題與對策［Ｊ］．福建林業(yè)科技， ２００６， ３３（１）：２０４．

［４］ 歐陽樂軍，曾富華．桉樹分子育種研究進(jìn)展［Ｊ］．分子植物育種， ２００８，６（６）：１１４６－１１５２．

［５］ 黃真池，歐陽樂軍，曾富華，等．尾葉桉的不同類型愈傷組織芽分化與某些相關(guān)生理生化指標(biāo)的關(guān)系［Ｊ］．植物生理學(xué)通訊，２０１０， ４６（２）：１４７．

［６］ ＨＵＡＮＧ Ｚ Ｃ， ＺＥＮＧ Ｆ Ｈ ， ＬＵ Ｘ Ｙ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ ｆｒｏｍ ｓｅｅｄｌｉｎｇ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２０１０，５４（１）：１３１－１３４．

［７］ 歐陽樂軍，黃真池，沙月娥，等．新型分裂素ＰＢＵ對尾巨桉胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響［Ｊ］．植物生理學(xué)報(bào)，２０１１，４７（８）：７８５－７９１．

［８］ ＨＥＩＮＴＺ Ｄ， ＥＲＸＬＥＢＥＮ Ａ， ＨＩＧＨ Ａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｓｓ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ ａｆｔｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００６，５（9）：２２８３－２２９３．

［９］ ＲＩＣＣＩ Ａ， ＢＥＲＴＯＬＥＴＴＩ Ｃ． Ｕｒｅａ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｖｅ： Cｙｔｏｋｉｎｉｎ－ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，１１（３）： ２６２－２７２．

［１０］ ＹＯＮＯＶＡ Ｐ． Chemlnform abstract：Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２０１０，３６（３－４）：１２４－１４７．

endprint

綠色愈傷組織誘導(dǎo)率＝（綠色愈傷組織塊數(shù)／總外植體數(shù)）×１００％

褐化率＝（褐色愈傷組織塊數(shù)／總外植體數(shù)）×１００％

２結(jié)果與分析

２．１種子消毒處理

用２０％次氯酸鈉溶液消毒２次，每次８ ｍｉｎ，播種３ ｄ后種子發(fā)芽率達(dá)１００％。第八天，幼苗長為３～５ ｃｍ，生長健壯，無畸形苗。表明這種方法既能將種子徹底消毒，又不會影響種子萌發(fā)。

２．２不同激素組合對尾葉桉愈傷組織大小的影響

由表１可知，６種激素組合中，ＰＢＵ＋ＩＡＡ組合誘導(dǎo)出直徑大于５ ｍｍ尾葉桉愈傷組織的比例最高，ＰＢＵ／ＩＡＡ的比值為１．０時(shí)，直徑大于５ ｍｍ的愈傷組織比例達(dá)８９％。ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ的激素組合誘導(dǎo)出直徑大于５ ｍｍ愈傷組織的比例最低，（ＴＤＺ＋ＰＢＵ）／ＩＡＡ的比值為３．０時(shí)，直徑大于５ ｍｍ愈傷組織的誘導(dǎo)率僅為１３％，其他比值的ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ組合幾乎不能誘導(dǎo)出直徑大于５ ｍｍ的愈傷組織。前期研究發(fā)現(xiàn)，較大的愈傷組織塊細(xì)胞分裂旺盛，分化潛力較大，不易褐化死亡［６］。

２．３不同激素組合對尾葉桉愈傷組織褐變的影響

由表２可知，６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素組合培養(yǎng)下尾葉桉愈傷組織褐化最為嚴(yán)重，平均褐化率為６３．７％。６－ＢＡ／ＩＡＡ＝４．０時(shí)，尾葉桉愈傷組織褐化率高達(dá)９３％。其他激素組合中尾葉桉愈傷組織平均褐化率差別較小，介于１０．６％與２０．０％之間。比較６個(gè)激素組合的平均褐化率，ＰＢＵ＋ＩＡＡ組合的平均褐化率最低， ６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素組合平均褐化率最高。ＰＢＵ和６－ＢＡ組合使用比單獨(dú)使用６－ＢＡ誘導(dǎo)出的愈傷組織的平均褐化率明顯降低。ＴＤＺ和６－ＢＡ組合使用也能有效防止褐化。但ＰＢＵ＋ＴＤＺ組合使用抑制愈傷組織褐化的效果不明顯。因此，ＰＢＵ既能明顯促進(jìn)尾葉桉愈傷組織塊的分裂和分化，又能減輕褐化。

２．４不同激素組合對尾葉桉愈傷組織分化的影響

尾葉桉外植體接種在含ＩＡＡ與不同濃度梯度的ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ、ＰＢＵ＋ＴＤＺ、ＴＤＺ＋６－ＢＡ、ＰＢＵ＋６－ＢＡ組合的ＳＰＣａ培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第七天尾葉桉愈傷組織從外植體的切割面長出，愈傷組織分化率為１００％。兩周后外植體兩端明顯膨大。５６ ｄ時(shí)，愈傷組織分化成綠色、紅色、白色、黃色、褐色愈傷。

從表３中可以看出，ＰＢＵ＋ＩＡＡ激素組合培養(yǎng)下尾葉桉綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最高，為３４．０％。６－ＢＡ＋ＩＡＡ組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最低，僅為１２.0％。其他幾種激素組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率介于２０．０％和２６．９％之間。可見，與６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ誘導(dǎo)胚性細(xì)胞形成和分化的能力更強(qiáng)。

２．５ＰＢＵ誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷及綠色愈傷組織的芽分化

觀察ＰＢＵ誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷組織，其表面濕潤，有光澤，呈淺綠色至深綠色。愈傷組織塊表面有多個(gè)可見顆粒，顆粒內(nèi)可見明顯的芽點(diǎn)（圖１Ａ）。芽點(diǎn)逐漸增大，芽尖突破愈傷表面，芽尖周圍分化出葉片，成為不定芽（圖１Ｂ）。前期研究發(fā)現(xiàn)，桉樹綠色愈傷細(xì)胞代謝旺盛，酶活性高，分化潛力大［５－７］。

３討論

桉樹的組織培養(yǎng)常因外植體啟動分裂難、形成的愈傷組織易褐變壞死、芽分化困難等原因難以成功。６－ＢＡ是人工合成的嘌呤類細(xì)胞分裂素。ＰＢＵ和ＴＤＺ是人工合成的雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素。它們在啟動外植體的細(xì)胞分裂分化和形成胚性愈傷組織中有廣泛的應(yīng)用。本研究分析了ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ和ＩＡＡ的激素組合條件下，尾葉桉愈傷組織的生長、褐化和分化情況，發(fā)現(xiàn)與６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ能明顯促進(jìn)愈傷組織塊的分裂和分化，減輕褐化，促進(jìn)不定芽的分化。

嘌呤類細(xì)胞分裂素６－ＢＡ雖然啟動尾葉桉愈傷組織分裂的能力較強(qiáng)，６－ＢＡ／ＩＡＡ的比值為２．０時(shí)，直徑大于５ ｍｍ愈傷組織的誘導(dǎo)率為３８％，但愈傷組織極易褐變壞死，失去分化能力。ＴＤＺ抑制褐化的效果與ＰＢＵ相近，但誘導(dǎo)形成的綠色愈傷組織誘導(dǎo)率明顯低于ＰＢＵ。

雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素可直接作用于細(xì)胞分裂素受體，引起下游信號網(wǎng)絡(luò)中酶的活化［８］。另外，雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素也可通過阻止細(xì)胞分裂素的降解或抑制細(xì)胞分裂素氧化酶活性減慢細(xì)胞分裂素的分解，從而提高植物細(xì)胞中細(xì)胞分裂素的濃度［９］。脲類細(xì)胞分裂素具有功能多樣、代謝穩(wěn)定、不易被氧化酶氧化、作用濃度低、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)［１０］。其中ＰＢＵ在桉樹的胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生中已顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢［５－７］。ＰＢＵ在桉樹分化和再生領(lǐng)域的獨(dú)特優(yōu)勢將推動桉樹的遺傳轉(zhuǎn)化，促進(jìn)桉樹遺傳改良工作。但ＰＢＵ抑制愈傷組織褐變，促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞分裂分化和不定芽分化的機(jī)理還有待深入研究。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 謝耀堅(jiān)．桉樹組織培養(yǎng)研究進(jìn)展［Ｊ］．世界林業(yè)研究，２０００，１３（６）：１４－１９．

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［６］ ＨＵＡＮＧ Ｚ Ｃ， ＺＥＮＧ Ｆ Ｈ ， ＬＵ Ｘ Ｙ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ ｆｒｏｍ ｓｅｅｄｌｉｎｇ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２０１０，５４（１）：１３１－１３４．

［７］ 歐陽樂軍，黃真池，沙月娥，等．新型分裂素ＰＢＵ對尾巨桉胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響［Ｊ］．植物生理學(xué)報(bào)，２０１１，４７（８）：７８５－７９１．

［８］ ＨＥＩＮＴＺ Ｄ， ＥＲＸＬＥＢＥＮ Ａ， ＨＩＧＨ Ａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｓｓ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ ａｆｔｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００６，５（9）：２２８３－２２９３．

［９］ ＲＩＣＣＩ Ａ， ＢＥＲＴＯＬＥＴＴＩ Ｃ． Ｕｒｅａ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｖｅ： Cｙｔｏｋｉｎｉｎ－ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，１１（３）： ２６２－２７２．

［１０］ ＹＯＮＯＶＡ Ｐ． Chemlnform abstract：Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２０１０，３６（３－４）：１２４－１４７．

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綠色愈傷組織誘導(dǎo)率＝（綠色愈傷組織塊數(shù)／總外植體數(shù)）×１００％

褐化率＝（褐色愈傷組織塊數(shù)／總外植體數(shù)）×１００％

２結(jié)果與分析

２．１種子消毒處理

用２０％次氯酸鈉溶液消毒２次，每次８ ｍｉｎ，播種３ ｄ后種子發(fā)芽率達(dá)１００％。第八天，幼苗長為３～５ ｃｍ，生長健壯，無畸形苗。表明這種方法既能將種子徹底消毒，又不會影響種子萌發(fā)。

２．２不同激素組合對尾葉桉愈傷組織大小的影響

由表１可知，６種激素組合中，ＰＢＵ＋ＩＡＡ組合誘導(dǎo)出直徑大于５ ｍｍ尾葉桉愈傷組織的比例最高，ＰＢＵ／ＩＡＡ的比值為１．０時(shí)，直徑大于５ ｍｍ的愈傷組織比例達(dá)８９％。ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ的激素組合誘導(dǎo)出直徑大于５ ｍｍ愈傷組織的比例最低，（ＴＤＺ＋ＰＢＵ）／ＩＡＡ的比值為３．０時(shí)，直徑大于５ ｍｍ愈傷組織的誘導(dǎo)率僅為１３％，其他比值的ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ組合幾乎不能誘導(dǎo)出直徑大于５ ｍｍ的愈傷組織。前期研究發(fā)現(xiàn)，較大的愈傷組織塊細(xì)胞分裂旺盛，分化潛力較大，不易褐化死亡［６］。

２．３不同激素組合對尾葉桉愈傷組織褐變的影響

由表２可知，６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素組合培養(yǎng)下尾葉桉愈傷組織褐化最為嚴(yán)重，平均褐化率為６３．７％。６－ＢＡ／ＩＡＡ＝４．０時(shí)，尾葉桉愈傷組織褐化率高達(dá)９３％。其他激素組合中尾葉桉愈傷組織平均褐化率差別較小，介于１０．６％與２０．０％之間。比較６個(gè)激素組合的平均褐化率，ＰＢＵ＋ＩＡＡ組合的平均褐化率最低， ６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素組合平均褐化率最高。ＰＢＵ和６－ＢＡ組合使用比單獨(dú)使用６－ＢＡ誘導(dǎo)出的愈傷組織的平均褐化率明顯降低。ＴＤＺ和６－ＢＡ組合使用也能有效防止褐化。但ＰＢＵ＋ＴＤＺ組合使用抑制愈傷組織褐化的效果不明顯。因此，ＰＢＵ既能明顯促進(jìn)尾葉桉愈傷組織塊的分裂和分化，又能減輕褐化。

２．４不同激素組合對尾葉桉愈傷組織分化的影響

尾葉桉外植體接種在含ＩＡＡ與不同濃度梯度的ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ、ＰＢＵ＋ＴＤＺ、ＴＤＺ＋６－ＢＡ、ＰＢＵ＋６－ＢＡ組合的ＳＰＣａ培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第七天尾葉桉愈傷組織從外植體的切割面長出，愈傷組織分化率為１００％。兩周后外植體兩端明顯膨大。５６ ｄ時(shí)，愈傷組織分化成綠色、紅色、白色、黃色、褐色愈傷。

從表３中可以看出，ＰＢＵ＋ＩＡＡ激素組合培養(yǎng)下尾葉桉綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最高，為３４．０％。６－ＢＡ＋ＩＡＡ組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最低，僅為１２.0％。其他幾種激素組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率介于２０．０％和２６．９％之間。可見，與６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ誘導(dǎo)胚性細(xì)胞形成和分化的能力更強(qiáng)。

２．５ＰＢＵ誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷及綠色愈傷組織的芽分化

觀察ＰＢＵ誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷組織，其表面濕潤，有光澤，呈淺綠色至深綠色。愈傷組織塊表面有多個(gè)可見顆粒，顆粒內(nèi)可見明顯的芽點(diǎn)（圖１Ａ）。芽點(diǎn)逐漸增大，芽尖突破愈傷表面，芽尖周圍分化出葉片，成為不定芽（圖１Ｂ）。前期研究發(fā)現(xiàn)，桉樹綠色愈傷細(xì)胞代謝旺盛，酶活性高，分化潛力大［５－７］。

３討論

桉樹的組織培養(yǎng)常因外植體啟動分裂難、形成的愈傷組織易褐變壞死、芽分化困難等原因難以成功。６－ＢＡ是人工合成的嘌呤類細(xì)胞分裂素。ＰＢＵ和ＴＤＺ是人工合成的雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素。它們在啟動外植體的細(xì)胞分裂分化和形成胚性愈傷組織中有廣泛的應(yīng)用。本研究分析了ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ和ＩＡＡ的激素組合條件下，尾葉桉愈傷組織的生長、褐化和分化情況，發(fā)現(xiàn)與６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ能明顯促進(jìn)愈傷組織塊的分裂和分化，減輕褐化，促進(jìn)不定芽的分化。

嘌呤類細(xì)胞分裂素６－ＢＡ雖然啟動尾葉桉愈傷組織分裂的能力較強(qiáng)，６－ＢＡ／ＩＡＡ的比值為２．０時(shí)，直徑大于５ ｍｍ愈傷組織的誘導(dǎo)率為３８％，但愈傷組織極易褐變壞死，失去分化能力。ＴＤＺ抑制褐化的效果與ＰＢＵ相近，但誘導(dǎo)形成的綠色愈傷組織誘導(dǎo)率明顯低于ＰＢＵ。

雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素可直接作用于細(xì)胞分裂素受體，引起下游信號網(wǎng)絡(luò)中酶的活化［８］。另外，雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素也可通過阻止細(xì)胞分裂素的降解或抑制細(xì)胞分裂素氧化酶活性減慢細(xì)胞分裂素的分解，從而提高植物細(xì)胞中細(xì)胞分裂素的濃度［９］。脲類細(xì)胞分裂素具有功能多樣、代謝穩(wěn)定、不易被氧化酶氧化、作用濃度低、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)［１０］。其中ＰＢＵ在桉樹的胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生中已顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢［５－７］。ＰＢＵ在桉樹分化和再生領(lǐng)域的獨(dú)特優(yōu)勢將推動桉樹的遺傳轉(zhuǎn)化，促進(jìn)桉樹遺傳改良工作。但ＰＢＵ抑制愈傷組織褐變，促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞分裂分化和不定芽分化的機(jī)理還有待深入研究。

參考文獻(xiàn)：

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［４］ 歐陽樂軍，曾富華．桉樹分子育種研究進(jìn)展［Ｊ］．分子植物育種， ２００８，６（６）：１１４６－１１５２．

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［７］ 歐陽樂軍，黃真池，沙月娥，等．新型分裂素ＰＢＵ對尾巨桉胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響［Ｊ］．植物生理學(xué)報(bào)，２０１１，４７（８）：７８５－７９１．

［８］ ＨＥＩＮＴＺ Ｄ， ＥＲＸＬＥＢＥＮ Ａ， ＨＩＧＨ Ａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｓｓ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ ａｆｔｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００６，５（9）：２２８３－２２９３．

［９］ ＲＩＣＣＩ Ａ， ＢＥＲＴＯＬＥＴＴＩ Ｃ． Ｕｒｅａ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｖｅ： Cｙｔｏｋｉｎｉｎ－ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，１１（３）： ２６２－２７２．

［１０］ ＹＯＮＯＶＡ Ｐ． Chemlnform abstract：Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２０１０，３６（３－４）：１２４－１４７．

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