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        不同激素組合對尾葉桉愈傷組織分化的影響

        2014-08-08 09:58:26蔡翼李志娟白明珍溫小芳彭麗君黃真池
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年9期
        關(guān)鍵詞:苯基

        蔡翼+李志娟+白明珍+溫小芳+彭麗君+黃真池+

        摘要:取8 d苗齡的尾葉桉(Eucalyptus urophylla Smith)幼苗下胚軸作外植體,以SPCa為基本培養(yǎng)基,添加N-苯基-N-噻唑基脲(PBU)、噻苯?。ǎ裕模冢ⅲ叮S基氨基嘌呤(6-BA)3類細(xì)胞分裂素與IAA進(jìn)行組合,研究細(xì)胞分裂素與生長素比值對尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明,接種56 d后,不同濃度PBU與IAA的組合誘導(dǎo)出直徑大于5 mm愈傷組織塊的比例高,愈傷組織塊褐化率低,形成的綠色愈傷組織塊的比例高。綠色愈傷組織容易分化出不定芽。說明這3類細(xì)胞分裂素中,PBU促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞分裂和分化的能力較強(qiáng),且能有效減輕褐變。

        關(guān)鍵詞:尾葉桉(Eucalyptus urophylla Smith);愈傷組織誘導(dǎo);N-苯基-N-噻唑基脲(PBU);噻苯?。ǎ裕模冢?;6-芐基氨基嘌呤(6-BA)

        中圖分類號:Q945.45;S79文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:0439-8114(2014)09-2177-04

        Effects of Different Hormone Combinations on Inducing

        Eucalyptus urophylla Smith Callus

        CAI Yia,LI Zhi-juana,BAI Ming-zhena,WEN Xiao-fanga,PENG Li-juna,HUANG Zhen-chia,b

        (a.Life Science and Technology School;b.Research Center of Resources Plant,Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048,Guangdong,China)

        Abstract: The effects of different hormone combination on inducing Eucalyptus urophylla Smith callus were studied by culturing the hypocotyls of 8-day-old seedlings on SPCa medium. The three kinds of cytokinins combined with Indole-3-acetic acid(IAA) were N-phenyl-N-[6-(2-chlorobenzothiazol)yl] urea(PBU), 1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) urea(TDZ),6-benzyladenine(6-BA). The results showed the combinations of PBU and IAA induced the most calli bigger than 5 mm in diameter at the 56th day. Meanwhile, the ratio of brown callus was the lowest and the ratio of green callus was the highest. The green calli were easy to produce adventitious bud. PBU was suitable for cell division and differentiation of Eucalyptus urophylla Smith callus. PBU could effectively reduce browning and promote adventitious bud formation in the three kinds of cytokinins.

        Key words: Eucalyptus urophylla Smith;callus induction; N-phenyl-N-[6-(2-chlorobenzothiazol)yl] urea(PBU);1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) urea(TDZ);6-benzyladenine(6-BA)

        桉樹(Eucalyptus robusta Smith)原產(chǎn)于澳大利亞,有700多種,具有速生、豐產(chǎn)、輪伐期短等特點(diǎn),是優(yōu)良的紙漿用材,經(jīng)濟(jì)效益顯著[1]。桉樹是世界上主要產(chǎn)材樹種之一,其人工造林已占世界人工造林的1/5,是世界上種植面積最大的闊葉樹種。我國是亞洲最大的桉樹種植國[2]。桉樹組織培養(yǎng)是林木組織培養(yǎng)研究最早、最多的一大類。早在1965年,Sussex通過赤桉實(shí)生苗外植體獲得了其愈傷組織。此后,國內(nèi)外學(xué)者先后利用桉樹木質(zhì)塊莖、節(jié)間、下胚軸、葉、成年桉樹嫩枝段等不同器官組織培養(yǎng)誘導(dǎo)完整植株成功[3]。目前,全世界已對60種桉樹進(jìn)行了組織培養(yǎng)技術(shù)的研究,至少30種桉樹已經(jīng)在離體愈傷培養(yǎng)中取得成功,然而植株成功再生的樹種較少[4]。桉樹作為含酚類和多糖豐富的木本植物,其再生系統(tǒng)的建立難度較大[5]。以桉樹為材料再生成功的報(bào)道中,常用6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、N-苯基-N-噻唑基脲(PBU)、噻苯?。ǎ裕模冢┑燃?xì)胞分裂素[5-7]進(jìn)行處理。

        本試驗(yàn)用8 d苗齡的尾葉桉幼苗下胚軸作為外植體,以CaCl2濃度提高到679.32 mg/L的改良SPCa培養(yǎng)基[6]為基本培養(yǎng)基, 添加不同濃度PBU、TDZ、6-BA和IAA的激素組合。接種56 d后,統(tǒng)計(jì)愈傷組織的生長和分化情況,探討適用于尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)的激素組合,分析激素組合和CTK/IAA比值對愈傷組織分化的影響,旨在為尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)及芽分化提供參考。

        1材料與方法

        1.1材料

        尾葉桉種子,購自國家林業(yè)局桉樹中心。

        1.2試劑

        N-苯基-N-噻唑基脲(PBU),由廣東省特色植物工程中心合成并純化;噻苯?。ǎ裕模冢停拢茫龋牛凸井a(chǎn)品;吲哚乙酸(IAA)和6-芐基氨基嘌呤(6-BA)為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

        1.3種子消毒

        將尾葉桉種子在蒸餾水中浸泡3 h后用70%的乙醇表面消毒45 s,用無菌水漂洗4次,清除殘留乙醇。再用20%的次氯酸鈉溶液消毒8 min,期間輕輕搖動三角瓶以提高滅菌效果。用無菌水漂洗4次后,再用20%的次氯酸鈉溶液浸泡8 min,用無菌水漂洗6次后,將種子播種到SPCa培養(yǎng)基上,置于25 ℃暗處萌發(fā)。

        1.4愈傷組織的誘導(dǎo)

        取高3~5 cm、僅含1對子葉、苗齡為8 d的無菌種子幼苗,切取8 mm長的下胚軸切段為外植體,接種于以SPCa為基本培養(yǎng)基,添加0.57 μmol/L IAA(吲哚乙酸)與不同濃度梯度的PBU、TDZ、6-BA、PBU+TDZ、TDZ+6-BA、PBU+6-BA組合的培養(yǎng)基上(設(shè)CTK/IAA分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0,共7個(gè)濃度梯度),置于(25±2) ℃,暗處培養(yǎng)2周。然后轉(zhuǎn)移至16 h/d光照、50 μmol/(m2·s)光照度、(25±2) ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6周,接種56 d后統(tǒng)計(jì)綠色和褐色愈傷組織的數(shù)量,計(jì)算綠色愈傷組織誘導(dǎo)率和褐化率并拍照。每種不同濃度梯度的激素組合設(shè)3次重復(fù),每次重復(fù)約30個(gè)外植體。

        endprint

        綠色愈傷組織誘導(dǎo)率=(綠色愈傷組織塊數(shù)/總外植體數(shù))×100%

        褐化率=(褐色愈傷組織塊數(shù)/總外植體數(shù))×100%

        2結(jié)果與分析

        2.1種子消毒處理

        用20%次氯酸鈉溶液消毒2次,每次8 min,播種3 d后種子發(fā)芽率達(dá)100%。第八天,幼苗長為3~5 cm,生長健壯,無畸形苗。表明這種方法既能將種子徹底消毒,又不會影響種子萌發(fā)。

        2.2不同激素組合對尾葉桉愈傷組織大小的影響

        由表1可知,6種激素組合中,PBU+IAA組合誘導(dǎo)出直徑大于5 mm尾葉桉愈傷組織的比例最高,PBU/IAA的比值為1.0時(shí),直徑大于5 mm的愈傷組織比例達(dá)89%。TDZ+PBU+IAA的激素組合誘導(dǎo)出直徑大于5 mm愈傷組織的比例最低,(TDZ+PBU)/IAA的比值為3.0時(shí),直徑大于5 mm愈傷組織的誘導(dǎo)率僅為13%,其他比值的TDZ+PBU+IAA組合幾乎不能誘導(dǎo)出直徑大于5 mm的愈傷組織。前期研究發(fā)現(xiàn),較大的愈傷組織塊細(xì)胞分裂旺盛,分化潛力較大,不易褐化死亡[6]。

        2.3不同激素組合對尾葉桉愈傷組織褐變的影響

        由表2可知,6-BA+IAA的激素組合培養(yǎng)下尾葉桉愈傷組織褐化最為嚴(yán)重,平均褐化率為63.7%。6-BA/IAA=4.0時(shí),尾葉桉愈傷組織褐化率高達(dá)93%。其他激素組合中尾葉桉愈傷組織平均褐化率差別較小,介于10.6%與20.0%之間。比較6個(gè)激素組合的平均褐化率,PBU+IAA組合的平均褐化率最低, 6-BA+IAA的激素組合平均褐化率最高。PBU和6-BA組合使用比單獨(dú)使用6-BA誘導(dǎo)出的愈傷組織的平均褐化率明顯降低。TDZ和6-BA組合使用也能有效防止褐化。但PBU+TDZ組合使用抑制愈傷組織褐化的效果不明顯。因此,PBU既能明顯促進(jìn)尾葉桉愈傷組織塊的分裂和分化,又能減輕褐化。

        2.4不同激素組合對尾葉桉愈傷組織分化的影響

        尾葉桉外植體接種在含IAA與不同濃度梯度的PBU、TDZ、6-BA、PBU+TDZ、TDZ+6-BA、PBU+6-BA組合的SPCa培養(yǎng)基中培養(yǎng),第七天尾葉桉愈傷組織從外植體的切割面長出,愈傷組織分化率為100%。兩周后外植體兩端明顯膨大。56 d時(shí),愈傷組織分化成綠色、紅色、白色、黃色、褐色愈傷。

        從表3中可以看出,PBU+IAA激素組合培養(yǎng)下尾葉桉綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最高,為34.0%。6-BA+IAA組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最低,僅為12.0%。其他幾種激素組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率介于20.0%和26.9%之間??梢姡c6-BA和TDZ相比,PBU誘導(dǎo)胚性細(xì)胞形成和分化的能力更強(qiáng)。

        2.5PBU誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷及綠色愈傷組織的芽分化

        觀察PBU誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷組織,其表面濕潤,有光澤,呈淺綠色至深綠色。愈傷組織塊表面有多個(gè)可見顆粒,顆粒內(nèi)可見明顯的芽點(diǎn)(圖1A)。芽點(diǎn)逐漸增大,芽尖突破愈傷表面,芽尖周圍分化出葉片,成為不定芽(圖1B)。前期研究發(fā)現(xiàn),桉樹綠色愈傷細(xì)胞代謝旺盛,酶活性高,分化潛力大[5-7]。

        3討論

        桉樹的組織培養(yǎng)常因外植體啟動分裂難、形成的愈傷組織易褐變壞死、芽分化困難等原因難以成功。6-BA是人工合成的嘌呤類細(xì)胞分裂素。PBU和TDZ是人工合成的雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素。它們在啟動外植體的細(xì)胞分裂分化和形成胚性愈傷組織中有廣泛的應(yīng)用。本研究分析了PBU、TDZ、6-BA和IAA的激素組合條件下,尾葉桉愈傷組織的生長、褐化和分化情況,發(fā)現(xiàn)與6-BA和TDZ相比,PBU能明顯促進(jìn)愈傷組織塊的分裂和分化,減輕褐化,促進(jìn)不定芽的分化。

        嘌呤類細(xì)胞分裂素6-BA雖然啟動尾葉桉愈傷組織分裂的能力較強(qiáng),6-BA/IAA的比值為2.0時(shí),直徑大于5 mm愈傷組織的誘導(dǎo)率為38%,但愈傷組織極易褐變壞死,失去分化能力。TDZ抑制褐化的效果與PBU相近,但誘導(dǎo)形成的綠色愈傷組織誘導(dǎo)率明顯低于PBU。

        雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素可直接作用于細(xì)胞分裂素受體,引起下游信號網(wǎng)絡(luò)中酶的活化[8]。另外,雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素也可通過阻止細(xì)胞分裂素的降解或抑制細(xì)胞分裂素氧化酶活性減慢細(xì)胞分裂素的分解,從而提高植物細(xì)胞中細(xì)胞分裂素的濃度[9]。脲類細(xì)胞分裂素具有功能多樣、代謝穩(wěn)定、不易被氧化酶氧化、作用濃度低、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[10]。其中PBU在桉樹的胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生中已顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢[5-7]。PBU在桉樹分化和再生領(lǐng)域的獨(dú)特優(yōu)勢將推動桉樹的遺傳轉(zhuǎn)化,促進(jìn)桉樹遺傳改良工作。但PBU抑制愈傷組織褐變,促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞分裂分化和不定芽分化的機(jī)理還有待深入研究。

        參考文獻(xiàn):

        [1] 謝耀堅(jiān).桉樹組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].世界林業(yè)研究,2000,13(6):14-19.

        [2] 祁述雄.中國桉樹[M].北京:中國林業(yè)出版社,2006.

        [3] 歐陽磊.桉樹組培快繁中存在的問題與對策[J].福建林業(yè)科技, 2006, 33(1):204.

        [4] 歐陽樂軍,曾富華.桉樹分子育種研究進(jìn)展[J].分子植物育種, 2008,6(6):1146-1152.

        [5] 黃真池,歐陽樂軍,曾富華,等.尾葉桉的不同類型愈傷組織芽分化與某些相關(guān)生理生化指標(biāo)的關(guān)系[J].植物生理學(xué)通訊,2010, 46(2):147.

        [6] HUANG Z C, ZENG F H , LU X Y. Efficient regeneration of Eucalyptus urophylla from seedling-derived hypocotyls[J]. Biol Plantarum,2010,54(1):131-134.

        [7] 歐陽樂軍,黃真池,沙月娥,等.新型分裂素PBU對尾巨桉胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響[J].植物生理學(xué)報(bào),2011,47(8):785-791.

        [8] HEINTZ D, ERXLEBEN A, HIGH A A, et al. Rapid alteration of the phosphoproteome in the moss Physcomitrella patens after cytokinin treatment[J]. Journal of Proteome Research, 2006,5(9):2283-2293.

        [9] RICCI A, BERTOLETTI C. Urea derivatives on the move: Cytokinin-like activity and adventitious rooting enhancement depend on chemical structure[J]. Plant Biology,2009,11(3): 262-272.

        [10] YONOVA P. Chemlnform abstract:Design,synthesis and properties of synthetic cytokinins.Recent advances on their application[J]. General and Applied Plant Physiology, 2010,36(3-4):124-147.

        endprint

        綠色愈傷組織誘導(dǎo)率=(綠色愈傷組織塊數(shù)/總外植體數(shù))×100%

        褐化率=(褐色愈傷組織塊數(shù)/總外植體數(shù))×100%

        2結(jié)果與分析

        2.1種子消毒處理

        用20%次氯酸鈉溶液消毒2次,每次8 min,播種3 d后種子發(fā)芽率達(dá)100%。第八天,幼苗長為3~5 cm,生長健壯,無畸形苗。表明這種方法既能將種子徹底消毒,又不會影響種子萌發(fā)。

        2.2不同激素組合對尾葉桉愈傷組織大小的影響

        由表1可知,6種激素組合中,PBU+IAA組合誘導(dǎo)出直徑大于5 mm尾葉桉愈傷組織的比例最高,PBU/IAA的比值為1.0時(shí),直徑大于5 mm的愈傷組織比例達(dá)89%。TDZ+PBU+IAA的激素組合誘導(dǎo)出直徑大于5 mm愈傷組織的比例最低,(TDZ+PBU)/IAA的比值為3.0時(shí),直徑大于5 mm愈傷組織的誘導(dǎo)率僅為13%,其他比值的TDZ+PBU+IAA組合幾乎不能誘導(dǎo)出直徑大于5 mm的愈傷組織。前期研究發(fā)現(xiàn),較大的愈傷組織塊細(xì)胞分裂旺盛,分化潛力較大,不易褐化死亡[6]。

        2.3不同激素組合對尾葉桉愈傷組織褐變的影響

        由表2可知,6-BA+IAA的激素組合培養(yǎng)下尾葉桉愈傷組織褐化最為嚴(yán)重,平均褐化率為63.7%。6-BA/IAA=4.0時(shí),尾葉桉愈傷組織褐化率高達(dá)93%。其他激素組合中尾葉桉愈傷組織平均褐化率差別較小,介于10.6%與20.0%之間。比較6個(gè)激素組合的平均褐化率,PBU+IAA組合的平均褐化率最低, 6-BA+IAA的激素組合平均褐化率最高。PBU和6-BA組合使用比單獨(dú)使用6-BA誘導(dǎo)出的愈傷組織的平均褐化率明顯降低。TDZ和6-BA組合使用也能有效防止褐化。但PBU+TDZ組合使用抑制愈傷組織褐化的效果不明顯。因此,PBU既能明顯促進(jìn)尾葉桉愈傷組織塊的分裂和分化,又能減輕褐化。

        2.4不同激素組合對尾葉桉愈傷組織分化的影響

        尾葉桉外植體接種在含IAA與不同濃度梯度的PBU、TDZ、6-BA、PBU+TDZ、TDZ+6-BA、PBU+6-BA組合的SPCa培養(yǎng)基中培養(yǎng),第七天尾葉桉愈傷組織從外植體的切割面長出,愈傷組織分化率為100%。兩周后外植體兩端明顯膨大。56 d時(shí),愈傷組織分化成綠色、紅色、白色、黃色、褐色愈傷。

        從表3中可以看出,PBU+IAA激素組合培養(yǎng)下尾葉桉綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最高,為34.0%。6-BA+IAA組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最低,僅為12.0%。其他幾種激素組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率介于20.0%和26.9%之間。可見,與6-BA和TDZ相比,PBU誘導(dǎo)胚性細(xì)胞形成和分化的能力更強(qiáng)。

        2.5PBU誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷及綠色愈傷組織的芽分化

        觀察PBU誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷組織,其表面濕潤,有光澤,呈淺綠色至深綠色。愈傷組織塊表面有多個(gè)可見顆粒,顆粒內(nèi)可見明顯的芽點(diǎn)(圖1A)。芽點(diǎn)逐漸增大,芽尖突破愈傷表面,芽尖周圍分化出葉片,成為不定芽(圖1B)。前期研究發(fā)現(xiàn),桉樹綠色愈傷細(xì)胞代謝旺盛,酶活性高,分化潛力大[5-7]。

        3討論

        桉樹的組織培養(yǎng)常因外植體啟動分裂難、形成的愈傷組織易褐變壞死、芽分化困難等原因難以成功。6-BA是人工合成的嘌呤類細(xì)胞分裂素。PBU和TDZ是人工合成的雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素。它們在啟動外植體的細(xì)胞分裂分化和形成胚性愈傷組織中有廣泛的應(yīng)用。本研究分析了PBU、TDZ、6-BA和IAA的激素組合條件下,尾葉桉愈傷組織的生長、褐化和分化情況,發(fā)現(xiàn)與6-BA和TDZ相比,PBU能明顯促進(jìn)愈傷組織塊的分裂和分化,減輕褐化,促進(jìn)不定芽的分化。

        嘌呤類細(xì)胞分裂素6-BA雖然啟動尾葉桉愈傷組織分裂的能力較強(qiáng),6-BA/IAA的比值為2.0時(shí),直徑大于5 mm愈傷組織的誘導(dǎo)率為38%,但愈傷組織極易褐變壞死,失去分化能力。TDZ抑制褐化的效果與PBU相近,但誘導(dǎo)形成的綠色愈傷組織誘導(dǎo)率明顯低于PBU。

        雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素可直接作用于細(xì)胞分裂素受體,引起下游信號網(wǎng)絡(luò)中酶的活化[8]。另外,雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素也可通過阻止細(xì)胞分裂素的降解或抑制細(xì)胞分裂素氧化酶活性減慢細(xì)胞分裂素的分解,從而提高植物細(xì)胞中細(xì)胞分裂素的濃度[9]。脲類細(xì)胞分裂素具有功能多樣、代謝穩(wěn)定、不易被氧化酶氧化、作用濃度低、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[10]。其中PBU在桉樹的胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生中已顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢[5-7]。PBU在桉樹分化和再生領(lǐng)域的獨(dú)特優(yōu)勢將推動桉樹的遺傳轉(zhuǎn)化,促進(jìn)桉樹遺傳改良工作。但PBU抑制愈傷組織褐變,促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞分裂分化和不定芽分化的機(jī)理還有待深入研究。

        參考文獻(xiàn):

        [1] 謝耀堅(jiān).桉樹組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].世界林業(yè)研究,2000,13(6):14-19.

        [2] 祁述雄.中國桉樹[M].北京:中國林業(yè)出版社,2006.

        [3] 歐陽磊.桉樹組培快繁中存在的問題與對策[J].福建林業(yè)科技, 2006, 33(1):204.

        [4] 歐陽樂軍,曾富華.桉樹分子育種研究進(jìn)展[J].分子植物育種, 2008,6(6):1146-1152.

        [5] 黃真池,歐陽樂軍,曾富華,等.尾葉桉的不同類型愈傷組織芽分化與某些相關(guān)生理生化指標(biāo)的關(guān)系[J].植物生理學(xué)通訊,2010, 46(2):147.

        [6] HUANG Z C, ZENG F H , LU X Y. Efficient regeneration of Eucalyptus urophylla from seedling-derived hypocotyls[J]. Biol Plantarum,2010,54(1):131-134.

        [7] 歐陽樂軍,黃真池,沙月娥,等.新型分裂素PBU對尾巨桉胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響[J].植物生理學(xué)報(bào),2011,47(8):785-791.

        [8] HEINTZ D, ERXLEBEN A, HIGH A A, et al. Rapid alteration of the phosphoproteome in the moss Physcomitrella patens after cytokinin treatment[J]. Journal of Proteome Research, 2006,5(9):2283-2293.

        [9] RICCI A, BERTOLETTI C. Urea derivatives on the move: Cytokinin-like activity and adventitious rooting enhancement depend on chemical structure[J]. Plant Biology,2009,11(3): 262-272.

        [10] YONOVA P. Chemlnform abstract:Design,synthesis and properties of synthetic cytokinins.Recent advances on their application[J]. General and Applied Plant Physiology, 2010,36(3-4):124-147.

        endprint

        綠色愈傷組織誘導(dǎo)率=(綠色愈傷組織塊數(shù)/總外植體數(shù))×100%

        褐化率=(褐色愈傷組織塊數(shù)/總外植體數(shù))×100%

        2結(jié)果與分析

        2.1種子消毒處理

        用20%次氯酸鈉溶液消毒2次,每次8 min,播種3 d后種子發(fā)芽率達(dá)100%。第八天,幼苗長為3~5 cm,生長健壯,無畸形苗。表明這種方法既能將種子徹底消毒,又不會影響種子萌發(fā)。

        2.2不同激素組合對尾葉桉愈傷組織大小的影響

        由表1可知,6種激素組合中,PBU+IAA組合誘導(dǎo)出直徑大于5 mm尾葉桉愈傷組織的比例最高,PBU/IAA的比值為1.0時(shí),直徑大于5 mm的愈傷組織比例達(dá)89%。TDZ+PBU+IAA的激素組合誘導(dǎo)出直徑大于5 mm愈傷組織的比例最低,(TDZ+PBU)/IAA的比值為3.0時(shí),直徑大于5 mm愈傷組織的誘導(dǎo)率僅為13%,其他比值的TDZ+PBU+IAA組合幾乎不能誘導(dǎo)出直徑大于5 mm的愈傷組織。前期研究發(fā)現(xiàn),較大的愈傷組織塊細(xì)胞分裂旺盛,分化潛力較大,不易褐化死亡[6]。

        2.3不同激素組合對尾葉桉愈傷組織褐變的影響

        由表2可知,6-BA+IAA的激素組合培養(yǎng)下尾葉桉愈傷組織褐化最為嚴(yán)重,平均褐化率為63.7%。6-BA/IAA=4.0時(shí),尾葉桉愈傷組織褐化率高達(dá)93%。其他激素組合中尾葉桉愈傷組織平均褐化率差別較小,介于10.6%與20.0%之間。比較6個(gè)激素組合的平均褐化率,PBU+IAA組合的平均褐化率最低, 6-BA+IAA的激素組合平均褐化率最高。PBU和6-BA組合使用比單獨(dú)使用6-BA誘導(dǎo)出的愈傷組織的平均褐化率明顯降低。TDZ和6-BA組合使用也能有效防止褐化。但PBU+TDZ組合使用抑制愈傷組織褐化的效果不明顯。因此,PBU既能明顯促進(jìn)尾葉桉愈傷組織塊的分裂和分化,又能減輕褐化。

        2.4不同激素組合對尾葉桉愈傷組織分化的影響

        尾葉桉外植體接種在含IAA與不同濃度梯度的PBU、TDZ、6-BA、PBU+TDZ、TDZ+6-BA、PBU+6-BA組合的SPCa培養(yǎng)基中培養(yǎng),第七天尾葉桉愈傷組織從外植體的切割面長出,愈傷組織分化率為100%。兩周后外植體兩端明顯膨大。56 d時(shí),愈傷組織分化成綠色、紅色、白色、黃色、褐色愈傷。

        從表3中可以看出,PBU+IAA激素組合培養(yǎng)下尾葉桉綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最高,為34.0%。6-BA+IAA組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率最低,僅為12.0%。其他幾種激素組合下綠色愈傷組織平均誘導(dǎo)率介于20.0%和26.9%之間。可見,與6-BA和TDZ相比,PBU誘導(dǎo)胚性細(xì)胞形成和分化的能力更強(qiáng)。

        2.5PBU誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷及綠色愈傷組織的芽分化

        觀察PBU誘導(dǎo)出的尾葉桉綠色愈傷組織,其表面濕潤,有光澤,呈淺綠色至深綠色。愈傷組織塊表面有多個(gè)可見顆粒,顆粒內(nèi)可見明顯的芽點(diǎn)(圖1A)。芽點(diǎn)逐漸增大,芽尖突破愈傷表面,芽尖周圍分化出葉片,成為不定芽(圖1B)。前期研究發(fā)現(xiàn),桉樹綠色愈傷細(xì)胞代謝旺盛,酶活性高,分化潛力大[5-7]。

        3討論

        桉樹的組織培養(yǎng)常因外植體啟動分裂難、形成的愈傷組織易褐變壞死、芽分化困難等原因難以成功。6-BA是人工合成的嘌呤類細(xì)胞分裂素。PBU和TDZ是人工合成的雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素。它們在啟動外植體的細(xì)胞分裂分化和形成胚性愈傷組織中有廣泛的應(yīng)用。本研究分析了PBU、TDZ、6-BA和IAA的激素組合條件下,尾葉桉愈傷組織的生長、褐化和分化情況,發(fā)現(xiàn)與6-BA和TDZ相比,PBU能明顯促進(jìn)愈傷組織塊的分裂和分化,減輕褐化,促進(jìn)不定芽的分化。

        嘌呤類細(xì)胞分裂素6-BA雖然啟動尾葉桉愈傷組織分裂的能力較強(qiáng),6-BA/IAA的比值為2.0時(shí),直徑大于5 mm愈傷組織的誘導(dǎo)率為38%,但愈傷組織極易褐變壞死,失去分化能力。TDZ抑制褐化的效果與PBU相近,但誘導(dǎo)形成的綠色愈傷組織誘導(dǎo)率明顯低于PBU。

        雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素可直接作用于細(xì)胞分裂素受體,引起下游信號網(wǎng)絡(luò)中酶的活化[8]。另外,雜環(huán)脲類細(xì)胞分裂素也可通過阻止細(xì)胞分裂素的降解或抑制細(xì)胞分裂素氧化酶活性減慢細(xì)胞分裂素的分解,從而提高植物細(xì)胞中細(xì)胞分裂素的濃度[9]。脲類細(xì)胞分裂素具有功能多樣、代謝穩(wěn)定、不易被氧化酶氧化、作用濃度低、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[10]。其中PBU在桉樹的胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生中已顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢[5-7]。PBU在桉樹分化和再生領(lǐng)域的獨(dú)特優(yōu)勢將推動桉樹的遺傳轉(zhuǎn)化,促進(jìn)桉樹遺傳改良工作。但PBU抑制愈傷組織褐變,促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞分裂分化和不定芽分化的機(jī)理還有待深入研究。

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