孫 凱，劉 娟，李 欣，凌婉婷

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所，南京 210095)

兩株具有芘降解功能的植物內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選及其特性

孫 凱，劉 娟，李 欣，凌婉婷*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所，南京 210095)

從植物體內(nèi)篩選具有多環(huán)芳烴 (PAHs) 降解功能的內(nèi)生細(xì)菌并定殖于植物體，有望有效地去除植物體內(nèi)PAHs，從而減低植物污染風(fēng)險(xiǎn)。采用富集培養(yǎng)法，從長期受PAHs污染的植物體內(nèi)分離篩選出2株能以芘為唯一碳源和能源生長的內(nèi)生細(xì)菌BJ03和BJ05，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特性及16S rDNA序列同源性分析，將2株菌分別鑒定為不動桿菌屬 (Acinetobactersp.) 和庫克氏菌屬 (Kocuriasp.)。并研究了2株內(nèi)生細(xì)菌對芘的降解能力及環(huán)境條件對其降解芘的影響。結(jié)果表明，菌株BJ03和BJ05在以濃度為50 mg/L的芘為唯一碳源生長時(shí)，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)15 d后，對芘的降解率分別為65.0%和53.3%。2株菌在pH值 (6.0 — 9.0)、溫度 (25 — 40 ℃) 和鹽濃度 (NaCl含量為0 — 15 g/L) 條件下生長良好，且皆為好氧生長，通氣量越大，菌株生長越旺盛，對芘的降解能力越強(qiáng)。添加C、N源可有效促進(jìn)菌株BJ03和BJ05的生長，加速其對芘的降解速率。當(dāng)外加C源為蔗糖、N源為酵母膏時(shí)，2株菌在30 ℃搖床培養(yǎng)4 d后，對芘的降解率分別高達(dá)71.1%和55.3%。2株菌的細(xì)胞表面疏水率最大分別為93.7%和43.9%，對四環(huán)素和利福平敏感，而對其它多種抗生素具有較強(qiáng)的抗性。

植物內(nèi)生細(xì)菌；多環(huán)芳烴；芘；降解；16S rDNA

土壤有機(jī)污染引起的植物污染風(fēng)險(xiǎn)已成為國際關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一[1- 2]。多環(huán)芳烴 (PAHs) 是土壤污染中廣泛存在的有機(jī)污染物，具有致癌、致畸、致突變作用，能通過食物鏈富集進(jìn)而威脅人群健康[3- 5]。芘是由4個苯環(huán)對稱排列組成的稠環(huán)芳烴，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是PAHs中一種典型的難降解高分子量代表化合物，被作為監(jiān)測PAHs污染的指示物和其它PAHs光化學(xué)降解、生物降解的模型分子之一[6- 7]。

植物內(nèi)生細(xì)菌是指能夠定殖在植物健康組織間隙或細(xì)胞內(nèi)，并與宿主植物建立和諧共生關(guān)系的一類微生物[8]。研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)生長繁殖過程中可產(chǎn)生生長素、酶類等次生代謝產(chǎn)物，影響植物體內(nèi)的激素水平，從而調(diào)節(jié)植物代謝，促進(jìn)植物生長，提高植物耐受性[9- 11]。同時(shí)，植物可為內(nèi)生細(xì)菌提供穩(wěn)定的生存環(huán)境和大量的營養(yǎng)物質(zhì)[12]。近年來，PAHs污染區(qū)功能內(nèi)生細(xì)菌的篩選及其與植物吸收代謝PAHs的關(guān)系引起了研究者關(guān)注。Ho等[13]從各種植物體內(nèi)分離出多種功能內(nèi)生細(xì)菌，并指出其中部分內(nèi)生細(xì)菌可提高PAHs污染土壤上植株的根長和生物量，增強(qiáng)植株對PAHs污染的耐受性。陳小兵等[14]研究指出，內(nèi)生細(xì)菌Enterobactersp. 7J2對一定濃度菲具有較好的降解效果，且該菌可在小麥體內(nèi)定殖，并能促進(jìn)小麥生長。由此，篩選具有PAHs降解特性的植物功能內(nèi)生菌并將其定殖在目標(biāo)作物上，有望調(diào)控植物對PAHs的抗性、吸收和代謝作用，進(jìn)而有效地規(guī)避植物PAHs污染風(fēng)險(xiǎn)。然而，國內(nèi)外相關(guān)資料仍很少。

本研究通過富集培養(yǎng)，從南京揚(yáng)子石化PAHs污染區(qū)植物體內(nèi)分離篩選出2株能以芘為唯一能源和碳源生長的植物內(nèi)生細(xì)菌，并系統(tǒng)地研究了其生物學(xué)特性和對芘的降解效能，以期為利用功能內(nèi)生細(xì)菌來調(diào)控植物代謝PAHs，進(jìn)而有效地規(guī)避作物污染風(fēng)險(xiǎn)提供新思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

芘 (純度>98%): 購于德國Fluka公司，分子量202.26 g/mol、純水中溶解度為0.12 mg/L、辛醇-水分配系數(shù) (logKow) 為5.18。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

供試植株 (小飛蓬和三葉草): 采自江蘇省南京市江寧揚(yáng)子石化芳烴廠排污口區(qū)。植株生長良好，采集后立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行芘降解菌的分離篩選。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，蒸餾水 1000 mL，pH 7.0 — 7.2。固體培養(yǎng)基加2.0%瓊脂。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基 (MSM)∶(NH4)2SO41.50 g/L，K2HPO4·3H2O 1.91 g/L，KH2PO40.50 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，微量元素溶液2 mL，蒸餾水1000 mL，pH 7.0 — 7.2。固體培養(yǎng)基加2.0%瓊脂。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

微量元素溶液：CoCl2·6H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.425 g/L，ZnCl20.05 g/L，NiCl2·6H2O 0.01 g/L，CuSO4·5H2O 0.015 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.01 g/L，Na2SeO4·2H2O 0.01 g/L。

芘降解培養(yǎng)基：1mg/mL的芘甲醇溶液過0.22 μm濾膜除菌，取一定量置于滅菌的三角瓶中，待甲醇揮發(fā)完，加入已滅菌的MSM培養(yǎng)液，除非說明，芘的終濃度為50 mg/L。

磷酸鹽緩沖液：K2HPO4·H2O 21.75 g/L，Na2HPO4·12H2O 33.4 g/L，KH2PO448.7 g/L，NH4Cl 5.2 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 具有芘降解功能的植物內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選

將新鮮植株用無菌水沖洗干凈，置于超凈臺內(nèi)用75%酒精漂洗3—5 min，無菌水沖洗3—4次，0.1%次氯酸鈉溶液漂洗3—5 min，無菌水再沖洗數(shù)次。將經(jīng)表面消毒的植物樣品移入LB固體平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h后，檢查平板上是否有細(xì)菌生長。經(jīng)檢驗(yàn)完全消毒后，將植株移入無菌研缽，用滅菌剪刀剪碎，加10 mL無菌水充分研磨，吸取5 mL上清液加入到100 mL芘降解培養(yǎng)基中，150 r/min、30 ℃避光搖床培養(yǎng)，每隔7 d轉(zhuǎn)接到新鮮的芘降解培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)接4次后，取培養(yǎng)液梯度稀釋并涂布于MSM固體平板 (培養(yǎng)基表面預(yù)先用50 mg/L芘甲醇溶液涂布)，30 ℃恒溫培養(yǎng)，待平板上長出菌落，經(jīng)反復(fù)的分離、篩選和純化，直至得到典型單菌落。挑選有明顯降解圈且長勢旺盛的菌株，進(jìn)行芘降解和菌種鑒定試驗(yàn)。

1.4 功能內(nèi)生細(xì)菌的菌懸液制備

將菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)48 h，8000 r/min離心5 min，棄上清液后，加入磷酸鹽緩沖液使菌體混合均勻，再次離心，重復(fù)2次，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整菌懸液OD600nm值為1.0，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 功能內(nèi)生細(xì)菌對芘的降解特性

1.5.1 菌株生長和芘降解率的測定

在芘濃度為50 mg/L的MSM培養(yǎng)基中，按5%的接種量加入菌懸液 (OD600nm值為1.0)，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)15 d，定時(shí)取樣，以不接種培養(yǎng)基做空白對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。分別用UVmini- 1240紫外分光光度計(jì)和高效液相色譜儀 (HPLC) 測定培養(yǎng)液中OD600nm值和芘濃度。芘濃度測定采用整瓶提取培養(yǎng)基的方法。向培養(yǎng)基中加入二倍體積色譜甲醇，30 min超聲萃取，高速離心后過0.22 μm濾膜，用島津高效液相色譜 (LC- 10AT) 測定芘濃度。高效液相色譜設(shè)定參數(shù)：Inertsil ODS-SP-C18反相色譜柱 (150 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相甲醇∶水=90∶10，流速1.000 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長245 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.5.2 環(huán)境條件對菌株生長和芘降解的影響

研究了pH、溫度、鹽濃度和通氣量對2株菌生長和芘降解的影響。將所篩選2株內(nèi)生細(xì)菌在LB液體培養(yǎng)基中活化48 h后，按照5%的接種量向芘降解培養(yǎng)基中加入菌懸液，分別設(shè)置不同的pH值 (4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、鹽濃度 (NaCl濃度為0、5g/L、10、15、20、25、30 g/L) 和裝液量 (10、20、30、40、50、60、70 mL，另設(shè)70 mL靜置培養(yǎng)作對照)，150 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)15 d，定時(shí)測定培養(yǎng)液中2株菌的OD600nm值和芘濃度。選擇不同的搖床溫度 (15、20、25、30、35、40、45 ℃)，150 r/min培養(yǎng)15 d，了解溫度對2株菌生長和芘降解的影響。

1.5.3 外加C、N源對菌株生長和芘降解的影響

以葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖作為外加C源；以硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、尿素、胰蛋白胨、酵母膏作為外加N源。外加C、N源的量均為100 mg/L。在芘降解培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)4 d，測定培養(yǎng)液中細(xì)菌生物量和芘的殘留濃度，并計(jì)算芘的降解速率。

1.6 功能內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)特性

1.6.1 細(xì)胞表面疏水率的測定

細(xì)胞表面疏水性采用BATH測定方法[15]。具體步驟如下：制備菌懸液，調(diào)整OD600nm值在0.60左右。取5 mL菌懸液置于試管中，按照梯度加入二甲苯 (0、1、2、3、4、5、6、7 mL)，室溫下劇烈振蕩1 min后，靜置5 min分層。用無菌注射頭快速吸取下相水溶液3 mL，以磷酸鹽緩沖液為對照，在600 nm波長下測定OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞表面疏水率CSH%= (對照組OD600nm-實(shí)驗(yàn)組OD600nm)/對照組OD600nm×100%。

1.6.2 抗性試驗(yàn)

研究了菌株BJ03和BJ05的抗性，將2株菌分別點(diǎn)接于不同濃度的抗生素平板 (抗生素：慶大霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素、壯觀霉素、四環(huán)素、利福平；濃度：10、20、50、75、100 mg/L)。以不加抗生素的LB固體平板作為陰性對照。于30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)皿中菌落生長情況。

1.7 菌種鑒定

1.7.1 生理生化特性分析

菌株的形態(tài)及生理生化特性測定參照文獻(xiàn)進(jìn)行[16]。

1.7.2 16S rDNA序列同源性分析

16S rDNA克隆所用正向引物為16S- 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物為16S-1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′(上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)。PCR反應(yīng)體系 (25L)：Premix 12.5L，模板DNA 1L，引物16S-27F 和引物16S-1492R 0.5L，重蒸水10.5L。PCR擴(kuò)增條件：(1) 須變性，94 ℃ 4 min；(2) 變性，94 ℃ 30 s，退火，55 ℃ 30 s，延伸，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；(3) 終極延伸，72 ℃ 10 min；(4) 保溫，10 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物的測序由南京金斯瑞測序有限公司完成。16S rDNA序列通過Genbank進(jìn)行Blast比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

2.1.1 菌株BJ03和BJ05的形態(tài)特征和生理生化特性

從南京受PAHs污染地區(qū)采集的小飛蓬和三葉草中分別分離篩選到1株芘降解內(nèi)生細(xì)菌BJ03和BJ05，均為革蘭氏陰性菌，無芽孢。菌株BJ03菌落呈白色，圓形，表面光滑，隆起，邊緣規(guī)則，菌體為桿狀。菌株BJ05菌落呈灰白色，凸起，邊緣整齊，菌體為球狀。生理生化試驗(yàn)見表1。

表1 菌株BJ03和BJ05的生理生化特性

+表示發(fā)酵糖類只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣及其它試驗(yàn)中呈陽性反應(yīng); -表示陰性反應(yīng)

2.1.2 菌株16S rDNA序列同源性分析

將菌株BJ03和BJ05的16S rDNA序列在Genebank中進(jìn)行比對，結(jié)果表明，菌株BJ03與多株Acinetobactersp.的序列相似性最大為97%，菌株BJ05與Kocuriasp.的序列相似性高達(dá)100%。結(jié)合2株菌的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析，初步將菌株BJ03和BJ05鑒定為不動桿菌屬 (Acinetobactersp.)和庫克氏菌屬 (Kocuriasp. )。

2.2 芘降解功能內(nèi)生細(xì)菌的生長和降解曲線

菌株BJ03和BJ05以芘為唯一碳源的生長和芘降解曲線見圖1。2株菌培養(yǎng)1 d，菌體數(shù)量均有所下降，可能是由于培養(yǎng)初期，MSM培養(yǎng)基中的芘濃度較高，2株菌生長不適應(yīng)，而芘本身的毒性又可對菌株產(chǎn)生不同程度的毒害作用，從而使菌體數(shù)量下降。在培養(yǎng)2—7 d內(nèi)，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，菌體數(shù)量逐漸增加，芘的降解率也逐漸增大。菌株BJ03和BJ05分別培養(yǎng)至第7天和第8天時(shí)，菌體數(shù)量達(dá)到最大值。之后，菌體數(shù)量有減小的趨勢，而芘的降解率增加緩慢，降解速率明顯降低。分析原因可能是由于菌株生長后期，培養(yǎng)液中芘的劇毒中間代謝產(chǎn)物的大量積累，影響到細(xì)菌體內(nèi)酶的活性，從而抑制了菌株的生長和芘降解基因的表達(dá)。培養(yǎng)15 d后，空白對照組中芘的回收率為94.6%，菌株BJ03和BJ05對芘的降解率分別為65.0%和53.3%，說明2株菌能以芘為唯一碳源和能源進(jìn)行生長且對芘具有一定的降解能力。根據(jù)培養(yǎng)液中芘殘留率隨時(shí)間的變化，擬合降解動力學(xué)曲線，菌株BJ03的降解動力學(xué)方程為c=108.42e-0.0754t，R2=0.9723，半衰期為10.3 d；菌株BJ05的降解動力學(xué)方程為c=108.97e-0.0518t，R2=0.9452，半衰期為15.0 d。式中，c表示芘殘留率%，t表示培養(yǎng)天數(shù)d。

圖1 以芘為唯一碳源時(shí)，2株菌的生長和芘降解曲線Fig.1 Utilization of pyrene as a sole source of carbon for growth and pyrene-degradation by two strains

2.3 環(huán)境條件對2株菌生長和芘降解的影響

pH和溫度是影響微生物生長的關(guān)鍵因素，優(yōu)選出最佳pH和溫度，提供微生物良好的生存環(huán)境，對微生物降解芘至關(guān)重要。由圖2可知，菌株BJ03和BJ05的適宜pH范圍為6.0—9.0。當(dāng)pH為7.0時(shí)， 2株菌生長最佳，對芘的降解率分別為65.6%和52.9%。在偏酸或偏堿性環(huán)境中，2株菌對芘的降解能力較低?？赡苁怯捎趶?qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下，抑制了菌株的生長，從而影響其對芘的降解效果。菌株BJ03在35 ℃時(shí)生長最快，對芘的降解率達(dá)到最大值69.4%；而菌株BJ05在30 ℃時(shí)生長最快，對芘的降解率達(dá)到最大值53.0% (圖2)。溫度較高或較低均會降低菌株BJ03和BJ05對芘的降解能力?？赡苁怯捎诟邷鼗虻蜏亟档土?株菌體內(nèi)芘降解酶的活性，從而影響菌株對芘的降解能力。

圖2 pH和溫度對2菌株生長和芘降解的影響Fig.2 Effect of pH and temperature on growth and pyrene-degradation capacity of two strains

鹽濃度和裝液量對植物內(nèi)生細(xì)菌生長及其對芘降解的影響見圖3。當(dāng)NaCl濃度為5 g/L時(shí)，菌株BJ03和BJ05的生長較好，對芘的降解最佳；當(dāng)NaCl濃度大于5 g/L時(shí)，2株菌的生長和對芘的降解率均有逐漸降低的趨勢 (圖3)。分析原因可能是由于較高的鹽濃度導(dǎo)致細(xì)胞脫水，從而抑制菌株的生長。通過改變?nèi)瞧恐信囵B(yǎng)基的裝液量來初步研究氧氣供給對菌株降解芘的影響。由圖3可知，裝液量與菌株的生長和芘的降解率成負(fù)相關(guān)，隨著裝液量的增加，菌株BJ03和BJ05的生長及芘的降解率均逐漸減小。當(dāng)裝液量為10 mL時(shí)，2株菌生長最好，對芘的降解率分別高達(dá)71.9%和63.9%。70 mL靜置對照組中2株菌的生長和芘的降解率最低，分析原因是靜置不利于培養(yǎng)液與空氣交換導(dǎo)致菌體供氧不足。因此可以得出結(jié)論，2株菌均為好氧生長。

圖3 NaCl濃度和裝液量對2菌株生長和芘降解的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration and liquid volume on growth and pyrene-degradation capacity of two strains

2.4 外加C、N源對2株菌生長和芘降解的影響

有研究表明[17]，在降解培養(yǎng)基中添加不同的C、N源，可促進(jìn)微生物的生長和對有機(jī)污染物的降解。添加C、N源對菌株BJ03和BJ05的生長及其對芘降解的影響見圖4和圖5，外加不同的C、N源對2株菌的生長和芘降解均會產(chǎn)生不同程度的影響。當(dāng)外加C源為蔗糖、N源為酵母膏時(shí)，搖床培養(yǎng)4 d后，菌株BJ03和BJ05的生物量和芘的降解率都明顯高于其它外加C、N源，2株菌的菌液OD600nm值分別為0.788和0.256，芘的降解率分別高達(dá)71.1%和55.3%，降解速率顯著提高。當(dāng)外加C源為蔗糖、N源為尿素時(shí)，4 d內(nèi)菌株BJ03和BJ05的培養(yǎng)液中OD600nm值分別為0.112和0.035，芘的降解率分別只有10.3%和10.2%。分析原因可能是由于蔗糖和酵母膏是微生物生長的良好營養(yǎng)物質(zhì)，它們的存在能促進(jìn)菌體的生命活動，進(jìn)而增強(qiáng)菌株對芘的代謝能力。而尿素的存在導(dǎo)致2株菌對芘的降解率很低，可能是由于尿素對2株菌的生長產(chǎn)生抑制作用或者2株菌不能利用尿素進(jìn)行良好生長，這一原因有待試驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。

圖4 外加C、N源對菌株BJ03生長和芘降解的影響Fig.4 Effect of exotic carbon and nitrogen sources on growth and pyrene-degradation capacity by strain BJ03

圖5 外加C、N源對菌株BJ05生長和芘降解的影響Fig.5 Effect of exotic carbon and nitrogen sources on growth and pyrene-degradation capacity by strain BJ05

圖6 細(xì)胞表面疏水性Fig.6 Cell surface hydrophobicity

2.5 菌株疏水性

細(xì)菌的細(xì)胞表面疏水性是決定細(xì)菌非特異性黏附到生物和非生物表面及界面的重要因素之一，也是影響細(xì)菌吸收和降解疏水性有機(jī)物的主要因素之一[15]。該試驗(yàn)測定了利用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)出的2株菌細(xì)胞表面疏水性，結(jié)果見圖6。菌株BJ03和BJ05的細(xì)胞表面疏水性不同，其最大疏水率分別為93.7%和43.9% (圖6)。菌體表面疏水性的不同可影響細(xì)胞攝取PAHs的方式，進(jìn)而影響PAHs分子的生物降解。菌株疏水性越強(qiáng)，芘在菌體表面的吸附結(jié)合越多。

2.6 抗性試驗(yàn)

明確降解菌株的抗性可為后期檢測其是否能成功定殖到植物體內(nèi)提供篩選標(biāo)記。將常用的8種抗生素以不同的濃度梯度分別加入到LB固體培養(yǎng)基中，觀察培養(yǎng)皿中菌落生長狀況。2株菌抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株BJ03對四環(huán)素和利福平較敏感，而對其它抗生素都具有較強(qiáng)的抗性；菌株BJ05對慶大霉素、四環(huán)素和利福平較敏感，對氨芐青霉素和卡那霉素等抗生素具有較好的抗性，結(jié)果見表2。

4 討論

目前國內(nèi)外已有的資料中，研究者主要通過添加外源化學(xué)制劑和菌根真菌等方法來調(diào)控植物對PAHs等有機(jī)污染物的吸收積累作用。高彥征等[18]研究指出，低濃度Tween80可促進(jìn)植物吸收PAHs，而濃度較高時(shí)則抑制植物對PAHs的吸收。近年來，程兆霞等[19]研究表明，接種叢枝菌根真菌Glomusmosseae和Glomusetunicatum可促進(jìn)植物吸收土壤中的芘，并顯著提高植株根、莖、葉對芘的積累量。Gao等[20]盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，接種PAHs降解菌 (Acinetobactersp. ) 能夠增加水稻根莖葉的生物量，加速PAHs污染土壤的生物修復(fù)。Rifat等[21]從原油污染區(qū)分離到2株具有萘、菲、熒蒽降解特性的Kocuriasp. CMG2028和CMG2042。然而，國內(nèi)外對能否利用功能內(nèi)生細(xì)菌降解有機(jī)污染物及其調(diào)控植物對有機(jī)污染物的吸收代謝作用的報(bào)道較少。

表2 菌株BJ03和BJ05的抗性試驗(yàn)結(jié)果

+：表示有抗性，-：表示無抗性

本研究從PAHs污染場地的植物體內(nèi)分離篩選到2株具有芘降解特性的功能內(nèi)生細(xì)菌BJ03和BJ05，并研究了環(huán)境條件對2株菌生長和芘降解的影響。結(jié)果表明，菌株BJ03和BJ05搖床培養(yǎng)15 d后對芘 (50 mg/L) 的降解率均在50%以上。2株菌均為好氧生長；對pH、溫度和NaCl濃度均有一定的適應(yīng)范圍；外加C源為蔗糖、N源為酵母膏時(shí)，2株菌的生長和對芘的降解速率顯著提高。

功能內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)的定殖分布已有較多報(bào)道，如劉云霞等[22]研究指出，植物內(nèi)生細(xì)菌可定殖于植物的根毛、葉片和維管組織等多種部位。劉忠梅等[23]用鏈霉素和利福平抗性標(biāo)記菌株B946，浸種處理，該菌能向小麥莖基部和葉內(nèi)轉(zhuǎn)移。有研究表明，植物體內(nèi)有機(jī)污染物的代謝是通過植物酶系進(jìn)行的，如P450、GSTs、過氧化物酶、超氧化物歧化酶和水解酶等[24- 25]。它們通過誘導(dǎo)有機(jī)污染物在植物體內(nèi)的許多降解反應(yīng)來控制其對污染物的選擇性和抗性。然而，能否將功能內(nèi)生細(xì)菌定殖在植物體內(nèi)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)酶系活性，增強(qiáng)植物對有機(jī)污染物的吸收代謝，進(jìn)而規(guī)避植物污染風(fēng)險(xiǎn)，國內(nèi)外尚缺乏研究和探索。針對本研究所篩選的2株芘降解內(nèi)生細(xì)菌BJ03和BJ05，分別點(diǎn)接于不同濃度的抗生素平板，結(jié)果表明2株菌對多種抗生素都有較好的抗性。因此，可以通過多種抗性篩選，檢測2株菌能否在目標(biāo)作物體內(nèi)良好定殖及其定殖后在植物體內(nèi)的分布。為進(jìn)一步探討內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)的傳導(dǎo)途徑及其對植物吸收積累 PAHs 的調(diào)控規(guī)律，了解內(nèi)生細(xì)菌對植物體內(nèi)主要酶系活性的響應(yīng)及其與植物代謝PAHs的關(guān)系等諸多問題提供前提條件。

5 結(jié)論

本研究從長期受PAHs污染的植物體內(nèi)分離篩選到2株能以芘為唯一碳源進(jìn)行生長的內(nèi)生細(xì)菌BJ03和BJ05，初步鑒定為不動桿菌屬 (Acinetobactersp. ) 和庫克氏菌屬 (Kocuriasp.)。在150 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)15 d后，2株菌對芘的降解率分別為65.0%和53.3%。菌株BJ03和BJ05的生長及其對芘的降解有一定的環(huán)境適應(yīng)能力，外加蔗糖和酵母膏能明顯地促進(jìn)2株菌的生長和芘降解。2株菌的細(xì)胞表面疏水率最大分別為93.7%和43.9%，且對多種抗生素具有較好的抗性。

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Isolation, identification, and performance of two pyrene-degrading endophytic bacteria

SUN Kai, LIU Juan, LI Xin, LING Wanting*

InstituteofOrganicContaminantControlandSoilRemediation,NanjingAgricultureUniversity,Nanjing210095,China

Anthropogenic soil contamination has become a worldwide environmental problem in the past decades. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are ubiquitous environmental pollutants in soil contaminated with crude oil, creosote, and coal tar. They are generated and dispersed into the environment by fossil fuel combustion, wood treatment processes, automobile exhaust, and waste incineration. The effect and fate of PAHs in soil is of great environmental and human health concern because of the carcinogenic, mutagenic, and teratogenic properties of PAHs. They have been frequently found in soils with high concentrations. PAHs present in soil may be absorbed by plants and translocated from roots to shoots, which is the major pathway for toxic organic substances to reach the food chain/web. Because plants form the basis of human and animal food chains, potentially harmful organic contaminants could find their way into human and animal populations via this route. Clearly, understanding the uptake of PAHs by plant and reducing the plant PAH contamination are essential for assessment of both the PAH exposure to humans and other animal species and the risk represented by PAH-contaminated soils.

Endophytic bacteria in plant tissues protect plants from external harsh environments and promote the plant growth. However, there is still little information available heretofore on the endophytic bacteria-influenced uptake and metabolism of PAHs by plants. We proposed that isolation of PAH-degrading endophytic bacteria from plant and colonization of them in the target plants are expected to improve the PAH degradation in plant, thereby reducing the risk of plant PAH contamination. In this study, two pyrene-degrading endophytic bacterial strains, named as BJ03 and BJ05, were isolated from plants grown in PAH-contaminated soils. They were individually identified asAcinetobactersp. andKocuriasp. based on the morphology, physiology, and 16S rDNA gene sequence analysis. The degradation characteristics of pyrene by strains BJ03 and BJ05 with different environmental conditions were investigated. It was observed that 65.0% and 53.3% of pyrene in culture solution were degraded by BJ03 and BJ05 at 30 ℃ and 150 r/min in 15 days, respectively. The two strains grew well under the condition of pH 6—9, 25—40 ℃, and NaCl concentrations of 0—15 g/L. BJ03 and BJ05 grew aerobically, and the stronger aeration resulted in their better growth and the faster degradation of pyrene in culture solution. The addition of exotic carbon (C) and nitrogen (N) sources in medium effectively promoted the bacteria growth and pyrene degradation. When sucrose and yeast extract were added as the respective C and N sources, 71.1% and 55.3% of pyrene were degraded by BJ03 and BJ05 within 4 days. BJ03 and BJ05 were observed with different cell surface hydrophobicity. The resistance tests revealed that the obtained two strains were sensitive to tetracycline and rifampicin, but were resistant to a variety of other antibiotics. This study provides new perspectives on the endophytic bacteria-influenced uptake of organic contaminants by plants. Results are valuable for the risk assessment of plant PAH contamination, and are instructive to the management of PAH-contaminated sites.

endophytic bacteria; polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs); pyrene; degradation; 16S rDNA

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41171380,41201501,51278252)；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2011M501246)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK2012370, BK20130030)

2012- 10- 09;

2013- 03- 04

10.5846/stxb201210091393

*通訊作者Corresponding author.E-mail: lingwanting@njau.edu.cn

孫凱，劉娟，李欣，凌婉婷.兩株具有芘降解功能的植物內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選及其特性.生態(tài)學(xué)報(bào),2014,34(4):853- 861.

Sun K, Liu J, Li X, Ling W T.Isolation, identification, and performance of two pyrene-degrading endophytic bacteria.Acta Ecologica Sinica,2014,34(4):853- 861.