丁東慧，于煒婷，劉袖洞，馬小軍

（1大連大學環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連116622；2中國科學院大連化學物理研究所，遼寧 大連116023）

隨著綠色化學的穩(wěn)定發(fā)展和社會可持續(xù)發(fā)展需求，傳統(tǒng)化學工業(yè)的高消耗、高污染已經(jīng)成為亟待解決的問題。在日益注重生產(chǎn)效率和環(huán)境保護的氛圍下，基于酶和微生物細胞的生物催化技術也取得突破性進展［1］，尤其是在生產(chǎn)精細化學品和藥物的工藝中，一些更加綠色和可持續(xù)的生物催化工藝正在取代傳統(tǒng)的化學合成路徑［2］；而且，為了克服底物或產(chǎn)物溶解度低、產(chǎn)物抑制等限制，對于需要高選擇性的一些精細化學品、手性中間體及藥物合成的工藝中還引入了非水相介質。相比于水相生物催化，非水相生物催化有很多潛在的優(yōu)勢：如更高的底物溶解性、水解反應的可逆性以及修飾酶的特異性［3］。

目前，在非水相生物催化的研究與應用中，人們依靠現(xiàn)代分析技術和精確的計算，對于催化劑活性、微觀酶結構、分子動力學和溶劑極性之間的關系有了深入的認識。例如，精確計算是利用計算機模擬非水相生物催化，從分子水平對酶行為細節(jié)進行研究，獲取活性和選擇性等有價值的信息，再將其與實驗結合，能夠更加全面地認識非水相生物催化過程［4］。

同時，為了實現(xiàn)生物催化過程的工業(yè)應用，更多的研究側重于如何提高生物催化劑活性和選擇性等方面。這主要涉及兩部分：一個是溶劑工程，即通過改變酶促反應的介質環(huán)境以調(diào)節(jié)酶活性和底物選擇性等性質的酶工程技術；另一個是生物催化工程，即通過篩選極端微生物、酶的改造和工程手段，提高生物催化劑的溶劑耐受性或者調(diào)節(jié)活性等，如定向篩選、蛋白質工程和固定化技術［2］。

1 非水相介質

生物催化系統(tǒng)主要由底物及產(chǎn)物、反應介質、生物催化劑三個基本要素構成。在非水相生物催化過程中，選擇條件溫和且無污染的反應介質［5］對于可持續(xù)發(fā)展尤其重要。

1.1 常規(guī)的水－有機溶劑介質

生物催化體系研究中，水－有機溶劑系統(tǒng)是研究相對全面的非水相介質。添加有機溶劑一方面能夠提高疏水性底物的利用率、降低底物或產(chǎn)物對生物催化劑的抑制；另一方面也可能影響生物催化劑活性和選擇性。因此，在選擇有機溶劑的時候必須綜合考慮上述兩個方面的影響［2，6］。

Kansal等［7］首先研究了有機溶劑與水形成的兩相體系對假絲酵母菌（C.viswanathii）活性的影響，包括二甲基亞砜（DMSO）、甲醇、二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇、異丙醇、正丙醇、己醇、苯、庚醇、己烷、癸醇和庚烷等12種溶劑。在水∶溶劑比為1∶1時，細胞活性保持率在己烷中最高（59%）而在DMSO中最低，表明較高的溶劑濃度（50%，體積比）對微生物是高毒性的。以苯乙酮為底物，在水－異丙醇（10%，體積比）中轉化率高達94%、對映體過量值（ee）＞99%；在水－乙醇和水－己烷中也都高于80%，優(yōu)于水相中76%的轉化率，但是水－己烷中的ee值為96%；而且添加異丙醇還增強了高溫下的操作穩(wěn)定性，45℃、50℃下均得到90%的轉換率和＞99%的ee值。上述結果說明低濃度溶劑對細胞活性影響較小，通過提高底物溶解度可以實現(xiàn)較高的轉化率，而選擇不同溶劑還可以調(diào)控酶的選擇性。此外，將細胞固定在海藻酸鈣凝膠中，在高濃度水－己烷（50%，體積比）兩相中細胞活性保持率達91%，遠高于游離細胞的59%，表明固定化技術可以提高細胞在高濃度有機溶劑中的長期穩(wěn)定性。

Cheng等［8］研究了酵母細胞中乙醇脫氫酶在水／己烷兩相體系中合成手性1－苯基－1－正丁醇的過程。在只含有輔因子Zn2＋的水相體系中（無己烷），（S）－1－苯基－1－正丁醇的產(chǎn)量是65.3%，ee值是93.0%；而在含有40%己烷的兩相體系中，（R）－1－苯 基－1－正 丁 醇 產(chǎn) 量 是9.6%，ee值 是90.9%。表明選擇合適的水－有機溶劑兩相可以影響對酶的對映選擇性。

侯丹丹等［9］研究了海藻酸鈉－殼聚糖微膠囊固定化酵母菌的生長代謝情況，結果顯示，在水－癸二酸二丁酯兩相中，微囊內(nèi)酵母細胞活性保持良好，微囊內(nèi)細胞的生長未受影響；底物L－苯丙氨酸的濃度在8～16g／L范圍內(nèi)，生物催化生產(chǎn)2－苯乙醇的過程呈現(xiàn)高轉化率，2－苯乙醇產(chǎn)量達4.5g／L，初步驗證了海藻酸鈉－殼聚糖微膠囊體系用于非水相催化的可行性。

Costas等［10］研究了有機溶劑對果膠微球固定化脂肪酶穩(wěn)定性的影響。結果表明，固定化脂肪酶在正己烷、正十四烷和正庚烷中的穩(wěn)定性與水相中類似，但在異丁醇、己醇等溶劑存在時穩(wěn)定性顯著下降。而且，將脂肪酶包埋在鈣離子交聯(lián)的果膠凝膠中，其在70%水－有機溶劑互溶體系中酶活性比單純水相中提高3～4倍。

Kapoor等［11］研究了4－硝基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯的脫羧羥醛反應，通過大孔丙烯酸載體固定化念珠菌，在60%的乙腈和40%水的反應介質中合成4－羥基－4－（4－硝基苯基）－丁酮－2－酮，反應72小時產(chǎn)率達99%。同時，為了提高反應速率以及增加產(chǎn)量，實驗中添加了30%（摩爾分數(shù)）的咪唑，速率從原來的85μmol／（L·min·mg）增加到了557μmol／（L·min·mg），產(chǎn) 率 在14h就 得 到98%，該結果表明，固定化念珠菌細胞在水－溶劑介質中具有很好的反應活性，而適當使用添加劑，能夠促進非水相介質中的生物轉化過程，有利于商業(yè)過程開發(fā)。

為了盡可能避免有機溶劑的不利影響，上述例子均結合了固定化技術，利用固定化載體能盡量避免生物催化劑與溶劑直接接觸，以降低溶劑的相毒性，因此增強了生物催化劑的活性和穩(wěn)定性，有利于反應向產(chǎn)物合成的方向進行。

1.2 新型非水相體系

近幾年來，除了致力于篩選具有合適物化性能和生物相容性的有機溶劑以及構建不同的水－有機溶劑組合，人們也嘗試一些新型非水相介質的應用，如將離子液體和超臨界二氧化碳流體等綠色溶劑應用于生物催化與生物轉化研究中。

1.2.1 離子液體

離子液體也被叫做熔化鹽，是由有機陽離子和不同陰離子組成的有機熔鹽。典型的離子液體是二烷基陽離子與弱陰離子（如MeOSO3或者PF6）的混合物。高級的離子液體膽堿檸檬酸鹽可生物降解，比較便宜，并且是毒性較小的陰離子和陽離子的組合［12－13］，因此有望用于生物催化并擴大到工業(yè)生產(chǎn)。

Maruyama等［14］研究發(fā)現(xiàn)，盡管天然脂肪酶粉末在離子液體中活性較低，但仍能將乙酸乙烯酯與2－苯基－1－丙醇醇解為2－苯基－1－丙基乙酸；當采用聚乙二醇（PEG）固定化脂肪酶，其在離子液體1－丁基－3甲基咪唑六氟磷酸鹽（［Bmim］［PF6］）中的反應活性明顯提高，在45℃下反應6h的產(chǎn)率就比游離酶高50%左右。同時比較了固定化脂肪酶在離子液體［Bmim］［PF6］、1－己基－3－甲基咪唑六氟磷酸鹽（［Hmim］［PF6］）、1－辛基－3－甲基咪唑六氟磷酸鹽（［Omim］［PF6］）和有機溶劑n－正己烷、異辛烷、DMSO、乙腈中的最初反應速率，離子液體中的速率比有機溶劑中要高出4倍左右。而且，PEG固定化脂肪酶在離子液體中醇解具有相對高的對映選擇性，在［Bmim］［Tf2N］中，ee值是98%，比［Hmim］［PF6］中的80%和［Omim］［PF6］中的77%要高，而后兩種離子液體的對映選擇性與在n－正己烷中是相當?shù)?，這些結果表明并不是所有的離子液體能夠提高對映選擇性，應該進行合適的篩選，以達到期望的結果，同時也表明將離子液體與固定化技術結合用于生物催化有很大的優(yōu)勢。

Shah等［15］將脂肪酶固定在多層碳納米管上，研究了其在非水相介質中的性能。實驗選取了兩種非水相介質進行對比，一個是己烷－水系統(tǒng)，與游離酶相比，固定化脂肪酶使得酯基轉移速率增加了22倍，丁酸丁酯的產(chǎn)率從14%增加到64%；另一個是離子液體［Bmim］［PF6］系統(tǒng)，速率增加14倍，產(chǎn)率達71%，而且固定化脂肪酶顯著提高了對映選擇性，ee值超過99%。通過比較可看出，固定化脂肪酶在離子液體中的活性及選擇性要優(yōu)于常規(guī)的水－有機溶劑系統(tǒng)。

分析認為，通過對陽離子和陰離子的適當組合或者改性可以調(diào)節(jié)離子液體極性和物質溶解性能，因此，它作為生物催化過程中的非水相介質表現(xiàn)出較強的底物或者產(chǎn)物溶解能力，進而會降低底物或者產(chǎn)物對生物催化劑的抑制作用；而且離子液體也不會破壞細胞膜，表現(xiàn)出較小的細胞和生物毒性，對于生物催化劑的活性、穩(wěn)定性和選擇性有一定增強作用［16－17］。另外，離子液體的使用還能夠簡化產(chǎn)品分離過程。盡管上述研究表明離子液體作為一種新型非水相介質，在生物催化過程中具有一定的優(yōu)越性，但是其在生物催化中的應用仍停留在實驗階段，待解決的主要問題有：離子液體的陰陽離子組合設計與生物催化劑性能的匹配、離子液體的純度與穩(wěn)定性、離子液體的高效回收利用及降低成本等。

1.2.2 超臨界流體

超臨界流體是指溫度和壓力稍高于臨界點時的一種特殊狀態(tài)流體（如CO2在31℃和7.38MPa以上的狀態(tài)），顯示出了獨特的性能：具有液體一樣的密度、溶解能力和傳熱系數(shù)，具有氣體一樣的低黏度和高擴散系數(shù)。在臨界狀態(tài)附近，溫度和壓力的微小變化會導致溶質的溶解度發(fā)生幾個數(shù)量級的突變，利用這一特性，超臨界流體可以溶解、分離物質，成為很有潛力的一種綠色反應介質［18］。

Lozano等［18］在離子液體與超臨界二氧化碳（scCO2）結合的介質中，研究了固定化脂肪酶催化合成環(huán)氧丙基酯的反應過程，這是因為離子液體能夠保證酶的活性，scCO2能夠很好的溶解、傳遞疏水性的底物。在35℃，7～18MPa條件下，即使底物濃度小也能夠完成合成反應，而且在scCO2中的反應速率是有機溶劑中的2倍，同時scCO2添加到離子液體中，混合體系的黏性僅是同樣條件下離子液體的1／5，顯著提高了物質的傳遞速率。

超臨界流體比較容易獲得，能夠溶解疏水和親水的溶質，對于酶反應具有一定的優(yōu)勢，但目前更多的是借助分子動力學模擬進行分析。通過模擬無水scCO2和純水中南極假絲酵母脂肪酶性能顯示，脂肪酶在水中比在純scCO2中更穩(wěn)定，但是在scCO2中添加少量水，就會增加酶的穩(wěn)定性。同時對離子液體－scCO2兩相進行模擬，結果顯示脂肪酶在兩相中比在單純的scCO2中更穩(wěn)定［4］，這些結果僅僅是分子動力學模擬的分析，實際操作還不成熟，但是將酶－離子液體系統(tǒng)在scCO2中進行生物轉化，過程更加干凈，為綠色化學工業(yè)發(fā)展開辟了一條新路。

1.2.3 質子惰性的有機溶劑

質子惰性的有機溶劑是非水相生物催化研究中的一種新介質。Egusa等［19］在質子惰性的非水溶劑N，N－二甲基乙酰胺中，研究了殼二糖合成長鏈甲殼素的過程，用蔗糖油酸表面活性劑包埋溶菌酶，再用質子酸做輔助催化劑，得到了較高的催化效率（40%～80%）。

Egusa等［20］還通過N，N－二甲基乙酰胺表面活性劑包埋纖維素酶，很好地保護了酶的活性，同時添加質子酸做輔助催化劑，在質子惰性的有機溶劑中成功從纖維二糖中直接高效地合成長鏈纖維素，并且合成纖維的聚合度也達到了120，濃度比普通的無酸系統(tǒng)高出了5倍。

上述結果表明質子惰性的有機溶劑作為生物催化反應的介質是可行的，并且在大規(guī)模的低聚糖、多糖的合成上也是很有效率的，只是現(xiàn)在還不是很成熟，應用范圍窄，需要進一步探索其在藥物、精細化學品等合成方面的應用性能，以更廣泛地應用于生物催化工程。

1.2.4 深低共熔溶劑

深低共熔溶劑［21］（DES）也是非水相生物催化中應用的一種新型綠色溶劑，是通過銨鹽與氫鍵供體的結合形成的，熔點接近室溫，具有低的揮發(fā)性和高的熱穩(wěn)定性，而且DES可生物分解，價廉易得，比多數(shù)離子液體具有明顯優(yōu)勢。

Durand等［21］在深低共熔溶劑中，研究了固定化南極假絲酵母脂肪酶進行乙烯基酯的酯基轉移反應，同時評價了不同鏈長度的醇類對底物極性的影響規(guī)律，結果顯示固定化脂肪酶有更好的活性，并且深低共熔溶劑中的氫鍵供體組分能夠和醇解反應競爭；同時研究了其他深低共熔溶劑在60℃生成正丁醇、正辛醇以及十八醇的濃度和選擇性的對比，如摩爾比1∶2的膽堿氯化物與尿素、摩爾比1∶2的膽堿氯化物與甘油、摩爾比1∶1的膽堿氯化物與草酸、摩爾比1∶1的膽堿氯化物與丙二酸等，其中脂肪酶在摩爾比為1∶2的膽堿氯化物與甘油中表現(xiàn)出更高的活性和選擇性，ee值可超過99%，這為脂肪酶催化提供了更多的選擇。

相比傳統(tǒng)的溶劑，深低共熔溶劑能很好保持酶的活性，但是在DES的具體例子中都是基于二羧基酸，其自身黏度就很高，隨著反應進行黏度會逐漸增加，使得攪拌和回收都很困難，從而影響反應的進行及產(chǎn)物分離。

2 固定化載體

在非水相生物催化中，保持或增強酶和微生物的活性和穩(wěn)定性是必須要考慮的方面，除了篩選極端微生物或通過定向進化等生物手段改造酶，固定化技術是一個簡單易行且行之有效的工程手段。固定化技術的關鍵之一就是所用載體材料的性能，一般要求具有良好的傳質性能、可保持酶或細胞的高活性、穩(wěn)定性好、機械強度高、價格低廉、適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等［22－24］。

常用的固定化載體可以分為無機載體（玻璃、硅凝膠、鋁、斑脫土等）、高分子載體（天然高分子和合成高分子），近年來還出現(xiàn)了新型的無載體固定化技術。

2.1 無機載體

無機載體具有穩(wěn)定性好、機械強度高、對微生物無毒性、不易被微生物所分解、耐酸堿、成本低、壽命長等優(yōu)點，因而其應用日益增多。

Zhang等［25］通過吸附法將釀酒酵母脂肪酶固定在水化碳酸氫氧鎂鋁載體上，用于生物柴油的生產(chǎn)。結果顯示，固定化脂肪酶活性在50℃時保留了95%，而游離酶是88%。從米根霉中提取的脂肪酶固定在CaCO3上，固定化的生物柴油產(chǎn)率在30min達到95%。但是吸附法的最大問題是容易造成酶的泄露及在溶劑中使用的活性損失［26］?？梢钥吹剑瑢τ谏锊裼蜕a(chǎn)，發(fā)展迅速的固定化技術滿足了工業(yè)化需求，在不久的將來會替代化學催化。

Vila－Real等［27］將柚苷酶固定化在四甲氧基硅烷和甘油組成的溶膠－凝膠基質上，研究了柚苷水解為還原糖的反應。實驗中選取了8種溶劑：二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、1，2－乙二醇二甲醚和1，4－二氧己烷，用來提高柚苷溶解性，并考察了柚苷酶的穩(wěn)定性和活性，同時對α－L－鼠李糖苷酶和β－D－葡萄糖苷酶進行評價。結果表明，在有機溶劑或者共溶劑的存在下，固定化酶仍能保留50%的活性，并且穩(wěn)定性也提高了；在水－四氫呋喃中，α－L－鼠李糖苷酶和β－D－葡萄糖苷酶的半衰期也分別增加了21倍和59倍。四甲氧基硅烷和甘油組成的溶膠－凝膠載體對于生物催化是一大創(chuàng)新，對將來更好地應用于生物催化顯示了很大的優(yōu)勢。

近年來二氧化硅載體成為研究的熱點。二氧化硅具有大比表面區(qū)域和可控制的孔徑，而且能根據(jù)特定酶的尺寸進行調(diào)整，被廣泛用于酶固定化的惰性載體［28］。Yu等［29］通過物理吸附、交聯(lián)和共價結合三種方法，將玫瑰念珠菌脂肪酶固定在多孔二氧化硅載體上，研究了其在異辛烷溶劑中對共軛亞油酸和乙醇的選擇性酯化作用。實驗中的二氧化硅通過嵌段共聚物的非離子表面活性劑、氨基化和戊二醛嫁接進行修飾，固定的玫瑰念珠菌脂肪酶活性比游離酶高8倍，同時也展現(xiàn)了高水平的酯化活性和操作穩(wěn)定性，并且在32h連續(xù)反應后總酯化作用的產(chǎn)率為43.2%～46.9%。共價結合法是表面功能團和固相支持物表面的反應基團之間形成化學共價鍵連接，該方法與載體結合緊密，使用過程中不易脫落，但反應激烈、條件較難控制，往往容易造成活性損失，應用并不廣泛。Cruz等［30］將南極假絲酵母脂肪酶用物理吸附法固定在二氧化硅納米顆粒中，研究了己烷中進行的n－乙酰－L－苯丙氨酸乙酯的酯基轉移反應，結果顯示酶活性顯著提高。

傳統(tǒng)的無機載體材料價廉易得、機械強度高、無毒且穩(wěn)定性好，一般是借助吸附法或經(jīng)小分子化學改性以共價鍵合方式固定化酶，幾乎不用于固定化細胞。但無機載體的結構不易調(diào)控，影響傳質且鍵合酶的能力差，因此，通過對無機載體進行修飾或者與有機載體結合使用、制備兼具優(yōu)良特性的載體成為今后研究的熱點。

2.2 高分子載體

高分子載體既可用作酶的固定化，也可用于微生物細胞的固定化。固定化細胞是在固定化酶基礎上逐步發(fā)展形成的，與酶固定化相比較，其具有以下優(yōu)點：①無須進行酶的分離提取；②酶的穩(wěn)定性高；③可進行細胞中多酶體系反應等。而且，固定化細胞具有密度大、可增殖、可實現(xiàn)反復使用、有利于產(chǎn)品的分離提取等特點，因此，固定化細胞技術在連續(xù)反應中占有明顯的優(yōu)勢，主要被應用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學、化學分析、環(huán)境保護、能源開發(fā)等領域［31］。高分子載體包括天然高分子和合成高分子［32］。

2.2.1 天然高分子載體

天然高分子材料的主要特點是來源廣泛、無毒、有良好的傳質性能。常見的天然高分子載體有海藻酸鈉、殼聚糖、淀粉、瓊脂、卡拉膠、纖維素、明膠、膠原等，其中瓊脂的機械強度較差［33］。另外，瓊脂或者纖維素衍生物等可以形成油包水微乳液的有機凝膠，應用在不同種酶催化反應中，能夠保留酶活性并且增加穩(wěn)定性［34］。但是天然高分子材料也存在強度低、厭氧條件下易被微生物分解、使用壽命短等缺點，所以在實際應用中受到一定程度的限制。

Quiroga等［35］將酶包埋在海藻酸鈣膠珠中，在4℃保存45天后，酶活性仍保留95%，20個水解反應周期后，活性維持在78%，固定化酶活性在縮氨酸的合成中比游離酶提高了26倍。這里用到的固定化方法是典型的包埋法［21］，是將細胞或酶包裹在凝膠網(wǎng)格結構或半透性聚合物薄膜內(nèi)，小分子底物和產(chǎn)物可自由擴散，而細胞或酶不會擴散到周圍的介質。

Garikipati等［36］利用海藻酸鈣載體固定大腸桿菌，在乙酸月桂酸酯／水的兩相體系中將萘轉化為萘酚，但是實驗中游離和固定化細胞損失60%，可能是有機溶劑的毒性造成的，但相比水相中而言，固定化細胞催化產(chǎn)物的產(chǎn)量提高了8倍。

張芳等［37］采用海藻酸鈉載體固定化紅酵母細胞，在水／有機溶劑兩相體系中考察了3，5－雙三氟甲基苯乙酮合成（S）－3，5－雙三氟甲基苯乙醇的反應。結果表明，固定化紅酵母細胞在5%辛烷中進行轉化，于30℃、pH＝8、1142mg／mL底物濃度并添加葡萄糖作為輔助底物的條件下，轉化效果最佳，經(jīng)6次重復使用，仍可保留50%的轉化活力。

盡管海藻酸鈉具有良好的生物相容性，是目前在生物技術和醫(yī)用組織工程等領域很有前景的生物材料，但在為數(shù)不多的非水相介質中應用時仍表現(xiàn)出機械強度差、溶劑相毒性和疏水物質傳遞難等問題，需要對其進行改性或與其他材料復合使用，以擴大它的應用。

Li等［38］研究了酵母酒精脫氫酶的固定化催化反應，將苯基乙醛酸催化形成苯乙醇酸，使用殼聚糖納米微粒作為載體，用靜電吸附和共價結合固定的方法，考察了固定化時間、酶濃度和pH值等條件，與游離酶比較，固定化酶保留原始活性的65%，顯示了更顯著的熱穩(wěn)定性和持久性。

韓鴻鵬等［39］選擇瓊脂、明膠、瓊脂－明膠3類載體固定化放線菌2235產(chǎn)生的纖維素酶，分別以羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）和濾紙為底物，測定不同方法固定化纖維素酶的活性，確定用于固定化纖維素酶的優(yōu)良載體。結果表明，明膠法固定化效果最差；瓊脂－明膠協(xié)同法固定化效果最優(yōu)，采用該方法測得的濾紙酶和CMC酶活性分別可達3317nkat·mL－1和8868nkat·mL－1。

2.2.2 合成高分子載體

合成高分子材料有較好的強度、較強的抵抗微生物分解性能，但是傳質性能比較差。它可以用作任何一種酶的固定化載體，如果包埋細胞會使細胞的活性有一定程度的降低［40］。常見的合成高分子有聚丙烯酸（PAA）、聚乙烯醇（PVA）、聚丙烯酰胺（PAM）、聚氨酯泡沫（PUF）等。

Yadav等［41］將脂肪酶固定在大孔聚丙烯酸樹脂上，在甲苯溶劑中進行丁基－4－甲基－3－氧化戊酸酯的合成，結果顯示，酯基轉移率為87%，產(chǎn)物純度達到98%，而且固定化酶是可以重復使用的。另外，他們還在微波照射的情況下，利用丙烯酸樹脂固定化南極假絲酵母脂肪酶，進行（±）－1－（1－萘基）乙醇的動力學拆分研究，在60℃和30mg固定化酶用量下于n－正庚烷溶劑中反應3h，產(chǎn)物濃度達到47.74%，同時對映選擇性為90.05%，實驗結果與計算模擬一致，具有極大的工業(yè)應用前景［42］。

Pavlidis等［43］研究了水－離子液體微乳液基礎的有機凝膠，這是一種新的固定化載體，當這種載體固定的酶被用在不同種類的極性和非極性的有機溶劑或者離子液體中時，酯化活性是油包水的微乳液有機凝膠固定化酶的44倍。這種固定化酶的活性在70℃仍保留幾個小時，半衰期也比在水－油微乳液中高25倍。

Arabi等［44］分別用海藻酸鈉、瓊脂、卡拉膠、聚乙烯醇為載體固定化念珠藻，在十六烷／水的催化體系中，將雄－4－3，17－二酮轉化為睪酮，不同載體的產(chǎn)率分別為瓊脂（25±18）%、卡拉膠（31±31）%、聚乙烯醇（36±6）%，而相比游離念珠藻（24±13）%的產(chǎn)率，海藻酸鈉固定化細胞顯示出更高的產(chǎn)率（72±23）%，比較可看出天然高分子載體的優(yōu)勢，而海藻酸鈉是最突出的。

以上都是常用于非水相生物催化的高分子載體，它們的性能比較如表1所示［2］。

表1 常用高分子載體材料的性能比較

雖然整體上看合成高分子載體有一定的優(yōu)勢，但是傳質性能差常導致反應效率低下及產(chǎn)物抑制等問題；天然高分子載體生物相容性好，對酶和細胞的毒性小，但需要進一步提高機械強度和在非水相介質中的適應性。

2.3 無載體固定化

無載體固定化技術是近年來發(fā)展起來的一種新型固定化方法。無載體酶固定化可能使用不同功能的交聯(lián)劑，如利用戊二醛交聯(lián)。另外，當一些酶在緊密靠近的時候，能夠通過交聯(lián)產(chǎn)生聚集體，如蛋白質晶體。

一方面，交聯(lián)酶聚集體（CLEAs）有一定的優(yōu)點：成本低、制備簡單、具有高單位活性和操作穩(wěn)定性、容易恢復和重新獲得，同時在水相中是完全穩(wěn)定的［45－46］。目前，CLEAs已經(jīng)用于抗生素合成及化合物手性拆分等領域，表現(xiàn)出較好的催化活性和操作穩(wěn)定性［47］。兩種或多種不同類型酶（水解酶、氧化還原酶和裂解酶）的聚合和交聯(lián)可以形成結合的CLEAs，適合利用多種酶的串聯(lián)過程進行工業(yè)相關的生物轉化，如將羥氰裂解酶、腈水解酶和酰胺酶構建成一個三層式立體交叉的結合－CLEA，置于反應器中成功實現(xiàn)苯甲醛到S－扁桃酸的一步轉化過程［45］。

另一方面，雖然具有制備過程簡單和催化性能優(yōu)良的特點，但由于酶的種類、純度和來源的差別，不同酶的CLEAs往往在制備及性質上存在差異，這就需要根據(jù)不同酶及所催化的反應特點來制備和使用CLEAs，才能將CLEAs技術應用于各類生物催化反應中。而且，在連續(xù)生物催化進程中，對于無載體的酶微粒，較差的機械強度和高壓縮性是值得考慮的問題［48］。

Lai等［49］研究了青霉菌脂肪酶交聯(lián)酶聚集體的催化性能并用于生物柴油的生產(chǎn)。實驗考察了交聯(lián)酶在水相、有機溶劑以及離子液體中的活性和穩(wěn)定性，結果顯示交聯(lián)酶在有機溶劑中的半衰期比在水相中要高一些，并且在離子液體［Bmim］［PF6］中，青霉菌脂肪酶交聯(lián)酶催化生產(chǎn)生物柴油的產(chǎn)率達到85.7%，從而表明青霉菌脂肪酶交聯(lián)酶聚集體在生物柴油的工業(yè)生產(chǎn)中具有一定的應用潛力。

正是基于高活性保留和穩(wěn)定性、高的催化生產(chǎn)力和產(chǎn)率，這種不需要載體的交聯(lián)酶聚集體具有相當大的工業(yè)應用潛能。而且將這種酶固定在微通道反應器中可以實現(xiàn)快速篩選和最優(yōu)化，并用于連續(xù)生產(chǎn)，這是生物催化技術的一大優(yōu)勢。交聯(lián)酶聚集體技術的發(fā)展將更多地集中在制備機理的分析、微觀結構的表征調(diào)控、與底物相互作用的研究以及應用體系的拓寬，并會與載體工程、溶劑工程等領域的新方法結合，以使其在生物催化和轉化中發(fā)揮更大的優(yōu)勢［46］。

3 展 望

非水相生物催化技術具有提高疏水性底物和產(chǎn)物溶解性、降低產(chǎn)物抑制、抑制水解反應等優(yōu)勢，近年來在手性中間體及藥物合成、精細化學品和生物能源生產(chǎn)等領域日益受到關注。目前，非水相生物催化技術的研究一方面集中在發(fā)現(xiàn)和篩選溶劑耐受性生物催化劑，利用合理設計及定向進化等技術改造酶以提高熱穩(wěn)定性或選擇性；另一方面則致力于探索與構建生物相容且與生物催化劑性能匹配的非水相介質，而且實現(xiàn)了離子液體、超臨界流體等新型介質中的生物催化過程，但是新型非水相介質要實現(xiàn)工業(yè)應用，還需達到規(guī)?；苽?、性能穩(wěn)定、可降解或易于回收、價格便宜以及適用范圍廣等要求。

固定化技術是傳統(tǒng)水相生物催化過程中保持酶或微生物活性及穩(wěn)定性的有效手段，而且能夠解決生物催化劑長期操作穩(wěn)定性差、難以回收再利用等問題，是工業(yè)應用環(huán)境中提高生物催化劑操作性能的一個相對簡單的技術。近年來，固定化技術與非水相介質結合用于生物催化過程的報道日漸增多，在保持酶或微生物活性及穩(wěn)定性、提高產(chǎn)率及調(diào)節(jié)反應選擇性等方面都取得一定效果，但是，固定化載體制備條件的溫和性、在非水相介質中的穩(wěn)定性、底物和產(chǎn)物傳質能力以及生物催化反應合成藥物、手性中間體的區(qū)域選擇性、立體選擇性以及對映選擇性等方面仍是需要努力的方向。

總之，非水相介質與固定化載體材料及方法的匹配與優(yōu)化，并且選擇合適的生物反應器結構和操作方式，才能更好的保證生物催化劑的活性和穩(wěn)定性，實現(xiàn)高效的生物轉化過程，推動非水相固定化生物催化在工業(yè)中的應用。

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