郭榮云，聶堯，穆曉清，徐巖，2，肖榮

（1江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2江南大學(xué)食品生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3羅格斯大學(xué)高級生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)中心，新澤西州 08854，美國）

度洛西汀，化學(xué)名(S)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)-1-丙胺，商品名為Cymbalta，是一種有效抑制5-羥色胺及去甲腎上腺素再攝取抑制劑（SNRI）。臨床上用其鹽酸鹽治療重癥抑郁癥、糖尿病性外周神經(jīng)疼痛及女性應(yīng)激性尿失禁。在與度洛西汀具有相同化學(xué)組成的兩種同分對映異構(gòu)體中，只有(S)-構(gòu)型具有抗抑郁的藥理活性[1]。目前，由于起始原料不同，不對稱合成手性度洛西汀的方法很多[2]。其中，(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP）是制備度洛西汀的重要手性中間體，因而通過(S)-專一性不對稱還原N,N-二甲基- 3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）已成為高效制備度洛西汀的一種重要途徑。

微生物法還原羰基化合物以其高效、專一、反應(yīng)條件溫和、立體選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為制備手性醇的重要手段[3-4]。目前，已篩選得到多株能夠不對稱還原制備度洛西汀中間體的微生物，如Exiguobacteriumsp.[5]、Thermoanaerobactersp.[6]、Candida tropicalis[7]、C. viswanathii[8]等。其中C. tropicalis、C. viswanathii能夠全細(xì)胞催化DKTP還原生成(S)-DHTP，并獲得＞80%的轉(zhuǎn)化率和高對映體過量值(＞99%)，但反應(yīng)底物濃度仍較低，反應(yīng)效率仍較為有限[7-8]。這可能是由于其細(xì)胞或胞內(nèi)功能酶的性質(zhì)局限性以及全細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)阻礙底物（DKTP）與酶的相互作用，從而影響時(shí)空產(chǎn)率[9]，進(jìn)而大大限制了其工業(yè)應(yīng)用。而且，目前國內(nèi)度洛西汀手性中間體的研究較少，且水平較低[10]。因此，有必要開發(fā)新型高選擇性的還原酶及其不對稱催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)體系，以實(shí)現(xiàn)(S)- DHTP的高效生物反應(yīng)制備。

近年來，直接利用已有的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行新型催化劑的開發(fā)已逐漸發(fā)展成為一種實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化的有效手段[11-12]。在微生物催化立體選擇性氧化還原反應(yīng)的研究中，C. parapsilosis表現(xiàn)出顯著的催化特性，是比較突出的立體選擇性氧化還原酶酶源[13]，如醛酮還原酶[14]、中鏈脫氫酶[15-16]、短鏈脫氫酶[15]。目前，C. parapsilosis中用于不對稱轉(zhuǎn)化的醛酮還原酶的開發(fā)應(yīng)用比較有限[17]，因此有必要進(jìn)一步挖掘新型的醛酮還原酶用于催化DKTP的不對稱轉(zhuǎn)化。本研究利用C. parapsilosis的基因組信息，從C. parapsilosisCCTCCM-203011中得到8個(gè)新型的醛酮還原酶，重組表達(dá)后，用其構(gòu)建粗酶反應(yīng)體系，催化還原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）生成(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP），見圖1。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Candida parapsilosis CCTCCM 203011菌株來自本實(shí)驗(yàn)室收藏，Escherichia colistrain XL-10 Gold、E. coliBL21 (DE3) 、pET21c質(zhì)粒購于美國Novagen公司，基因操作試劑均購自大連寶生物有限公司。

圖1 粗酶體系催化還原DKTP生成 (S)-DHTP

N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）、(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP）均購自浙江九洲藥業(yè)股份有限公司；氨芐青霉素、 IPTG均購自上海生工生物技術(shù)有限公司；輔酶NADPH、NADP+均購自上海索萊寶生物科技有限公司；正己烷（色譜純）、異丙醇（色譜純）均購自Tedia公司；其他分析純試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌株的構(gòu)建和菌體培養(yǎng)

使用在線分析軟件NCBI（http：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）利用C. parapsilosis基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.sanger.ac.uk/sequencing/Candida/ parapsilosis/）在C. parapsilosisCCTCC M203011中挖掘得到8個(gè)同源醛酮還原酶序列，見表1[18-19]。設(shè)計(jì)引物（表1）擴(kuò)增獲得醛酮還原酶編碼區(qū)基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET21c，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行活性表達(dá)。

重組大腸桿菌在含50μg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中于37℃、200r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，于17℃、200r/min 誘導(dǎo)表達(dá)12h。

1.2.2 粗酶液的制備

將誘導(dǎo)表達(dá)后的發(fā)酵液于8000r/min離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌3次，重懸于0.1mol/L磷酸鉀緩沖液（pH=6.5）中（細(xì)胞濃度為100g/L），超聲波破碎細(xì)胞。破碎條件：工作時(shí)間1s，間隔時(shí)間3s，總工作時(shí)間5min。4℃的條件下12000r/min 離心15min，收集上清液作為粗酶液用于不對稱催化反應(yīng)。

1.2.3 酶促不對稱還原DKTP合成 (S)-DHTP

2mL磷酸鉀緩沖液（0.1mol/L，pH=6.5）中含有1mL粗酶液（總蛋白含量5mg）及5g/L DKTP、輔助底物糖（醇）（10g/L）、NADPH（0.1mmol/L）和NADP+（0.1mmol/L），置于30℃、200r/min的搖床中L反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，加入2倍體積乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用高效液相色譜儀分析產(chǎn)物光學(xué)純度及產(chǎn)率。本文中的生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)均重復(fù)3次，然后取其平均值。

1.2.4 產(chǎn)物DHTP的分析

產(chǎn)物分析在Agilent 1200型液相色譜儀上進(jìn)行，色譜柱為Chiralcel OD-H柱 (4.6mm × 25cm；日本Daicel Chemical公司)，流動相為正己烷∶異丙醇（8∶2，體積比），流速為0.6mL/min，檢測波長為241nm。(R)-DHTP及(S)-DHTP的保留時(shí)間分別為15.48min、16.78min，底物DKTP的保留時(shí)間為28.27min。

轉(zhuǎn)化率（X）和產(chǎn)物ee值的計(jì)算公式如式（1）、式（2）。

表1 基于基因組數(shù)據(jù)庫挖掘得到的潛在醛酮還原酶基因及其引物序列

式中，Co為底物的初始濃度；CP為反應(yīng)終止時(shí)產(chǎn)物的濃度；CS、CR分別為 (S)-DHTP、(R)-DHTP 的濃度。

1.2.5 催化反應(yīng)條件的優(yōu)化

在1.2.3節(jié)的不對稱反應(yīng)條件下，在1g/L DKTP時(shí)，考察8個(gè)醛酮還原酶重組菌不對稱還原 DKTP 的能力，篩選出能夠高立體選擇性催化還原生成光學(xué)活性 (S)-DHTP 的優(yōu)良菌株。在此基礎(chǔ)上，在5g/L DKTP時(shí)考察了輔底物、輔酶濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)初始pH值、底物濃度對重組大腸桿菌粗酶液反應(yīng)體系不對稱還原DKTP生成光學(xué)活性(S)-DHTP的影響，旨在優(yōu)化催化反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 不對稱還原DKTP的新型醛酮還原酶的基因組挖掘

利用C. parapsilosis的基因組信息，通過與conjugated polyketone reductase C1的序列相似性挖掘得到8個(gè)醛酮還原酶（CPARs）基因核苷酸編碼序列，這些序列編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)與conjugated polyketone reductase C1具有15%～42%的同源性，說明通過基因組挖掘得到的讀碼框序列編碼新型的潛在醛酮還原酶。利用重組大腸桿菌分別表達(dá)8種潛在醛酮還原酶編碼基因，構(gòu)建了醛酮還原酶工具箱。這8株重組大腸桿菌經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞破碎后，進(jìn)行粗酶催化反應(yīng)，篩選能夠高立體選擇性不對稱還原 DKTP 生成光學(xué)活性的 (S)-DKTP的醛酮還原酶，結(jié)果見表2。酶促不對稱還原DKTP發(fā)現(xiàn)，CPARs 均為NADPH依賴型（結(jié)果未顯示），CPAR4在DKTP 1g/L時(shí)，產(chǎn)物ee值大于99%，產(chǎn)率達(dá)到 95.2%，具有不對稱還原DKTP生成 (S)-DHTP的立體專一性。

表2 不同醛酮還原酶催化還原 DKTP 的特性對比

2.2 粗酶體系催化還原DKTP生成(S)-DHTP的 研究

目前，醛酮還原酶不對稱催化還原羰基化合物的主要反應(yīng)類型為全細(xì)胞、純酶、粗酶催化。其中，全細(xì)胞催化因能利用細(xì)胞自生的輔酶代謝途徑進(jìn)行輔酶再生而備受關(guān)注，但全細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)阻礙底物（DKTP）與酶的相互作用，從而影響其時(shí)空產(chǎn)率[9]，進(jìn)而大大限制了其工業(yè)應(yīng)用；純酶催化因具有較高的反應(yīng)速率和較少的副反應(yīng)而優(yōu)勢明顯，但酶純化及輔酶添加（或建立輔酶再生體系）會大大提高反應(yīng)成本；粗酶催化因含有細(xì)胞內(nèi)部全部的酶，能夠利用其中自有的酶系統(tǒng)構(gòu)建自組裝的輔酶循環(huán)系統(tǒng)，解決細(xì)胞膜對底物（DKTP）的屏障及輔酶循環(huán)問題。因此，本研究采用CPAR4粗酶液構(gòu)建粗酶體系催化還原DKTP生成(S)-DHTP的 研究。

2.2.1 輔助底物對粗酶體系轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

由于醛酮還原酶在催化立體選擇性氧化還原反應(yīng)過程中，需要輔助底物作輔酶循環(huán)系統(tǒng)的供氫體，因此，有必要研究輔助底物對反應(yīng)的影響。因此本研究選擇多種糖類（蔗糖、葡萄糖、木糖、麥芽糖、果糖、乳糖）和醇類（甘油、乙醇、異丙醇、山梨醇）作為輔助底物進(jìn)行研究，考察其對轉(zhuǎn)化作用的影響，結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多種糖類及醇類能夠作為此自組裝輔酶循環(huán)系統(tǒng)的輔助底物。其中糖類中效果最好的是果糖和乳糖，在四種醇類中效果最好的是乙醇和異丙醇。多種糖類及醇類對反應(yīng)的促進(jìn)作用暗示了粗酶體系中存在多種可以用作輔酶循環(huán)的酶類。由于乳糖可被細(xì)胞粗酶液中的水解酶類水解為半乳糖和葡萄糖，其在粗酶液中的代謝過程伴隨著輔酶的產(chǎn)生，這可能解釋乳糖對反應(yīng)具有最佳的促進(jìn)作用。雖然乙醇、異丙醇對催化反應(yīng)也具有較佳的促進(jìn)作用，但其促進(jìn)作用仍低于乳糖，且醇類化合物的極性大對生物催化劑易產(chǎn)生抑制作用[20]。綜合考慮，本研究選擇乳糖作為輔助底物進(jìn)行下一步研究。

表3 輔助底物對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

2.2.2 輔酶濃度對粗酶體系轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

TTN（total turnover number，TTN）指每摩爾輔酶所能生成的目的產(chǎn)物的摩爾數(shù)，是衡量輔酶利用效率的一個(gè)重要指標(biāo)，以及評價(jià)輔酶再生方法是否具備良好再生能力和應(yīng)用前景的一個(gè)重要指標(biāo)。因此，本研究考察了輔酶NADPH和NADP+濃度對反應(yīng)的影響，如表4所示。結(jié)果顯示NADP+和NADPH濃度對反應(yīng)影響基本一致，由于氧化型輔酶NADP+的價(jià)格低于還原性輔酶NADPH的價(jià)格，NADP+作為輔酶用于反應(yīng)是一個(gè)更為經(jīng)濟(jì)的選擇。在底物濃度為5g/L，NADP+濃度為0.01mmol/L時(shí)，反應(yīng)的TTN可達(dá)883，但其產(chǎn)率僅有32.4，當(dāng)NADP+濃度為0.02mmol/L時(shí)，反應(yīng)的TTN為852，產(chǎn)率為62.5%。在兼顧產(chǎn)率及TTN的情況下，NADP+濃度為0.02mmol/L是最適輔酶濃度。

2.2.3 反應(yīng)溫度對粗酶體系轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

由于粗酶體系中細(xì)胞內(nèi)部的酶類失去了細(xì)胞膜 的保護(hù)，對溫度非常敏感。因此有必要研究溫度對粗酶催化的不對稱反應(yīng)的影響，如圖2所示。研究結(jié)果表明，反應(yīng)的溫度對產(chǎn)物的產(chǎn)率和光學(xué)純度都有一定的影響，在溫度低于30℃時(shí)，隨著溫度的升高，產(chǎn)物產(chǎn)率逐漸增大，產(chǎn)物的光學(xué)純度保持在99%以上；而當(dāng)反應(yīng)溫度高于30℃時(shí)，隨著溫度的升高，產(chǎn)物產(chǎn)率和光學(xué)純度都減小，一方面由于高溫使酶失活，產(chǎn)率減?。涣硪环矫娈?dāng)反應(yīng)溫度超過30℃時(shí)，可能由于酶立體選擇性的改變導(dǎo)致產(chǎn)物光學(xué)純度降低。因此，30℃為反應(yīng)最適溫度，產(chǎn)物ee值為99%，產(chǎn)物產(chǎn)率可達(dá)70.9%。

表4 輔酶濃度對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

圖2 溫度對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

2.2.4 反應(yīng)pH值對粗酶體系轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

在生物催化的反應(yīng)過程中，反應(yīng)體系的pH值不僅會影響酶的構(gòu)型、穩(wěn)定性以及活性中心的解離狀態(tài)，還會影響輔酶體系和反應(yīng)中氫傳遞及電子轉(zhuǎn)移。生物催化體系pH值對DKTP的不對稱還原效率的影響如圖3所示。研究結(jié)果表明，初始pH值小于6時(shí)，CPAR4的產(chǎn)率及光學(xué)純度受影響較大，隨著pH值的升高，產(chǎn)物產(chǎn)率及光學(xué)純度逐漸增大；而pH值大于6時(shí)，CPAR4的產(chǎn)率及光學(xué)純度受影響較小。因此，pH=6.5為反應(yīng)最適pH值。

2.2.5 底物濃度對粗酶體系轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

圖3 pH值對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

圖 4 底物濃度對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

對于傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑來說，生物催化劑的主 要劣勢在于較低的底物耐受性。底物濃度對不對稱還原反應(yīng)催化的影響如圖4所示，在底物濃度小于3g/L時(shí)，隨著底物濃度的升高，產(chǎn)率略有下降；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?g/L時(shí)，產(chǎn)率依然達(dá)到94.5%。繼續(xù)提高底物濃度時(shí)，產(chǎn)率有一定的下降。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?g/L 時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到71.2%，且底物濃度進(jìn)一步增加至6g/L時(shí)，產(chǎn)率仍有50%左右。說明底物DKTP本身對粗酶體系有較大影響，且該酶體系對高濃度的DKTP具有一定的耐受性。

3 結(jié) 論

本研究利用C. parapsilosis的基因組信息，挖掘得到8個(gè)新型的醛酮還原酶（CPARs）基因，構(gòu)建醛酮還原酶工具箱（重組大腸桿菌分別表達(dá)8 種醛酮還原酶）。在構(gòu)建的8株重組菌中，CPAR4能夠高立體選擇性地不對稱還原DKTP得到 (S)-DHTP。為進(jìn)一步提高底物DKTP的轉(zhuǎn)化率、構(gòu)建CPAR4的粗酶催化反應(yīng)體系，此反應(yīng)體系需要乳糖作為輔助底物以及極少量NADP+作為起始輔酶。通過此粗酶反應(yīng)體系的優(yōu)化，3g/L的DKTP產(chǎn)率達(dá)到94.5%，光學(xué)純度大于99.9%，這與目前報(bào)道的最高水平相當(dāng)[21]。研究結(jié)果進(jìn)一步證明，基于基因組信息挖掘，可以有效獲得用于制藥和精細(xì)化工行業(yè)的新型高效生物催化劑。此外， 針對生物催化不對稱氧化還原反應(yīng)的傳質(zhì)、電子傳遞等問題，建立具有自身輔酶再生能力的粗酶催化體系具有一定的應(yīng)用潛力。

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