朱莉麗，楊凱，劉亞

論著·臨床

肝癌患者血漿PEDF和VEGF表達(dá)水平及其 與預(yù)后關(guān)系的探討

朱莉麗，楊凱，劉亞

目的觀察肝癌患者血漿色素上皮衍生因子(PEDF)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)水平并探討其與預(yù)后的關(guān)系。方法采用ELISA法檢測肝癌患者43例(肝癌組)、肝臟良性疾病患者20例(良性肝病組)及健康對(duì)照者20例(健康對(duì)照組)血漿PEDF和VEGF水平；肝癌患者平均隨訪(12.02±0.23)個(gè)月，記錄短期主要不良終點(diǎn)事件(SMAE)發(fā)生情況。結(jié)果血漿PEDF水平肝癌組較良性肝病組及健康對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，VEGF水平明顯升高(P<0.01)，而良性肝病組與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。肝癌患者隨訪結(jié)束后，高PEDF/VEGF比值(≥3)亞組22例發(fā)生SMAE 3例(13.64%)，低PEDF/VEGF比值(<3)亞組21例發(fā)生SMAE 7例(33.33%)，Kaplan-Meier生存曲線顯示2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)。另外，與未發(fā)生SMAE的肝癌患者(33例)比較，發(fā)生SMAE者(10例)有更低的PEDF/VEGF比值(2.14±0.76 vs. 3.49±1.12,P<0.01)。結(jié)論P(yáng)EDF和VEGF參與肝癌的病理生理過程，低表達(dá)的PEDF及高表達(dá)的VEGF反映肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移情況，兩者比值可能成為預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的有效指標(biāo)。

肝癌；色素上皮衍生因子；血管內(nèi)皮生長因子；預(yù)后；關(guān)系

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的惡性實(shí)體腫瘤之一[1]，新生血管形成是其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中極為關(guān)鍵的步驟[2]。當(dāng)腫瘤生長至1 mm3以上時(shí)即需要腫瘤內(nèi)血管生成，否則腫瘤靜止于休眠狀態(tài)而不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，一旦進(jìn)入血管生長期腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能即迅速出現(xiàn)[3]。在眾多血管新生調(diào)控因子中，色素上皮衍生因子(PEDF)與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)發(fā)揮重要作用。PEDF抑制VEGF引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，選擇性地抑制新生血管的形成，具有很強(qiáng)的抗血管生成作用[4，5]。因此，本研究應(yīng)用ELISA法檢測肝癌、良性肝臟疾病及健康對(duì)照3組人群血漿PEDF及VEGF水平，探討其與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年5月—2013年5月診治的肝癌患者43例，均符合肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，根據(jù)臨床癥狀、體征、超聲或CT檢查及腫瘤標(biāo)記物等生化指標(biāo)確診，作為肝癌組，其中男29例，女14例；年齡26～68(57.3±8.7)歲；鱗癌21例，腺癌11例，腺鱗癌6例，小細(xì)胞肺癌5例；病程1～4(2.2±1.0)年，不伴有其他系統(tǒng)腫瘤。入選同期我院診治的良性肝臟疾病患者20例為良性肝病組，其中男14例，女6例，年齡25～66(55.8±9.2)歲；慢性肝炎18例，肝硬化13例，肝囊腫9例。另外，隨機(jī)選擇同期健康查體者20例作為健康對(duì)照組，男16例，女4例；年齡24～61(49.7±10.5)歲，排除可能引起血漿PEDF改變的其他疾病，如其他系統(tǒng)腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病、酒精性肝病、銀屑病等。3組研究對(duì)象性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)，具有可比性。試驗(yàn)過程中血標(biāo)本采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 血漿PEDF和VEGF含量檢測 (1)血漿標(biāo)本采集： 3組研究對(duì)象分別于清晨空腹抽取肘靜脈血4 ml(EDTA抗凝)，以3 000 r/min離心15 min，微量移液器取上清，-80℃保存待測。(2)PEDF與VEGF檢測：血漿PEDF和VEGF含量檢測采用ELISA法，試劑盒均購自深圳晶美生物工程有限公司，靈敏度分別為0.2 ng/ml、5 pg/ml，批內(nèi)及批間變異均<9.5%。試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，每份標(biāo)本檢測2孔，取平均值。酶標(biāo)儀450 nm處進(jìn)行檢測，5 min內(nèi)測定各孔吸光度值(OD)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出PEDF及VEGF水平。

1.3 預(yù)后隨訪 通過門診、住院或電話隨訪肝癌患者短期不良終點(diǎn)事件(short-term major adverse events,SMAE)發(fā)生情況，包括肝癌轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)、嚴(yán)重并發(fā)癥或死亡等，死亡患者記錄死亡時(shí)間及死亡原因。

2 結(jié) 果

2.1 血漿PEDF及VEGF水平 健康對(duì)照組、良性肝病組和肝癌組血漿PEDF水平分別為(12.25±2.19)μg/ml、(11.16±2.09)μg/ml 、(6.10±1.24)μg/ml。與健康對(duì)照組及良性肝病組比較，肝癌組患者血漿PEDF明顯降低(P<0.01)，良性肝病組與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。見圖1。3組研究對(duì)象血漿VEGF水平分別為(61.88±15.87)μg/ml、(63.47±13.94 )μg/ml和(194.80±14.60)μg/ml，與健康對(duì)照組及良性對(duì)照組比較，肝癌組患者血漿VEGF水平明顯升高(P<0.01)。見圖2。

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.01；與良性肝病組比較，#P<0.01

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.01；與良性肝病組比較，#P<0.01

2.2 肝癌患者PEDF/VEGF比值與近期預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)PEDF/VEGF比值將所有肝癌患者分為高PEDF/VEGF比值(≥3)亞組22例和低PEDF/VEGF比值(<3)亞組21例，結(jié)果顯示：高PEDF/VEGF比值亞組發(fā)生SMAE 3例(13.64%)，低PEDF/VEGF比值亞組發(fā)生SMAE 7例(33.33%)，2亞組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)。見圖3。

圖3 不同PEDF/VEGF比值亞組肝癌患者生存曲線

2.3 SMAE比較 43例患者均完成隨訪工作。平均隨訪(12.02±0.23)個(gè)月后，記錄患者SMAE發(fā)生情況。43例肝癌患者共發(fā)生SMAE 10例，包括死亡1例，肝癌破裂出血1例，骨轉(zhuǎn)移2例，胸水2例，復(fù)發(fā)4例；與未發(fā)生SMAE者(33例)相比，發(fā)生SMAE者(10例)血漿PEDF/VEGF比值明顯降低(3.49±1.12 vs. 2.14±0.76)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

肝癌是一種多血質(zhì)的實(shí)體腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸很大程度上依賴于新生血管形成。PEDF是目前最有效的天然血管抑制劑之一，具有強(qiáng)烈的血管生成抑制作用[7]。其作用機(jī)制包括：激活Fas/FasL系統(tǒng)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[8]，抑制毛細(xì)管道形成，抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移[9]，抑制VEGF表達(dá)和修飾VEGFR1[10]。另外，PEDF和細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合作用，抑制血管新生，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。有研究表明，低氧條件HCC細(xì)胞株分泌PEDF受抑制，而新生血管刺激因子——VEGF卻明顯增高[11]。VEGF是一種以亞基內(nèi)及亞基間二硫鍵交聯(lián)形成的同源雙聚體糖蛋白，與其受體Flt-1和KDR特異性結(jié)合后，發(fā)揮多種功能，如促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，增加血管通透性，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的傳導(dǎo)路徑，對(duì)抗其凋亡過程等[12]。因此，生理情況下血漿中微量的PEDF與VEGF一般不參與新生血管形成，兩者共同作用維持正常的血管密度和通透性。

本結(jié)果顯示，與良性肝病患者及健康對(duì)照者比較，HCC患者血漿PEDF水平明顯降低，VEGF含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明肝癌發(fā)生時(shí)，促血管新生的VEGF與拮抗血管新生的PEDF平衡失調(diào)，致病理性新生血管大量產(chǎn)生，加劇腫瘤生長及轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PEDF/VEGF比值越低者，其近期肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等不良事件發(fā)生率越高。其機(jī)制可能為腫瘤迅速增長致間質(zhì)壓力增加，引起毛細(xì)血管受壓閉合和連續(xù)性腫瘤壞死，缺氧負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制抑制抗血管新生因子PEDF表達(dá)，而啟動(dòng)促血管生成因子VEGF大量表達(dá)，重建腫瘤的血供系統(tǒng)，為腫瘤生長、轉(zhuǎn)移提供充足養(yǎng)分，進(jìn)而形成了腫瘤生長轉(zhuǎn)移和血管生成的惡性循環(huán)。

綜上所述，血漿PEDF和VEGF在肝癌發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，兩者可作為肝癌診斷和判斷預(yù)后的新腫瘤標(biāo)記物。此外，腫瘤新生血管是目前重組人PEDF或VEGF拮抗劑等多種抗血管新生藥物的作用靶點(diǎn)，可能為腫瘤治療提供更廣闊的前景。

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Therelationshipbetweenplasmalevelsofpigmentepithelialderivedfactorandvascularendothelialgrowthfactorinthepatientswithhepatocellularcarcinomaandprognosis

ZHULili,YANGKai,LIUYa.

DepartmentofGeneralSurgery，BeijingHaidianHospital,Beijing100080,China

YANGKai，E-mail:zlilii@126.com

ObjectiveTo observe the expression of pigment epithelium derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in liver cancer patients, and to explore its relationship with the prognosis.MethodsELISA was used to detect 43 cases of patients with hepatocellular carcinoma (HCC group), 20 patients with benign liver disease (benign liver disease group) and 20 cases of healthy controls' (healthy control group) levels of plasma PEDF and VEGF levels, patients with hepatocellular carcinoma with average follow-up (12.02 ± 0.23) months, the main short recording adverse events (SMAE) occurrence were recorded.ResultsThe levels of plasma PEDF of liver cancer group decreased than in benign liver disease group and healthy control group (P<0.01), VEGF level increased significantly (P<0.01), and benign disease group and the healthy control group had no significant difference (P>0.05). At the end of the follow-up of patients with hepatocellular carcinoma, high ratio of PEDF/VEGF subgroup (22 cases, PEDF/VEGF≥3) SMAE occurred in 3 patients (13.64%), low PEDF/VEGF ratio subgroup (21 cases, PEDF/VEGF < 3) SMAE occurred in 7 patients (33.33%), Kaplan-Meier survival curve showed statistically significant differences between the 2 groups (P=0.039). In addition, compared with without the occurrence of SMAE in patients with hepatocellular carcinoma (33 cases), patients with occurrence of SMAE (10 cases) with lower PEDF/VEGF ratio (2.14 ± 0.76 vs. 3.49 ± 1.12,P<0.01).ConclusionPEDF and VEGF have role in the pathophysiology of hepatocellular carcinoma, low expression of PEDF and high expression of VEGF reflects the development and metastasis of HCC, the ratio between the two may be an effective index to predict the metastasis and prognosis of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma;Pigment epithelium derived factor;Vascular endothelial growth factor;Prognosis；Correlation

100080 北京市海淀醫(yī)院/北京大學(xué)第三醫(yī)院海淀院區(qū)普外科

楊凱，E-mail:zlilii@126.com

10.3969/j.issn.1671-6450.2014.06.017

2014-03-12)