周菲菲+郝再彬+易克賢+鄭金龍+王秀麗+

摘要：以綠色環(huán)保發(fā)酵生產(chǎn)提取劍麻（Agave sisalana perr.ex Engelm）總皂苷為目標(biāo)，采集土壤樣品，對(duì)菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩得到１株菌株，編號(hào)ＪＭＺ－Ｎ０６。通過(guò)料液比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵液初始ｐＨ四因素三水平的正交試驗(yàn)，確定了該菌的最適發(fā)酵條件為料液比１∶２０（g∶mL），發(fā)酵時(shí)間６０ ｈ，發(fā)酵溫度３２ ℃，發(fā)酵液初始ｐＨ ６．０。

關(guān)鍵詞： 劍麻（Agave sisalana perr.ex Engelm）；正交試驗(yàn)；發(fā)酵條件；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：Ｑ８１５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０14）08－1863-05

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ Extracting Agave sisalana perr.ex Engelm Ｔｏｔａｌ Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ

ＺＨＯＵ Ｆｅｉ－ｆｅｉ１， ＨＡＯ Ｚａｉ－ｂｉｎ１， ＹＩ Ｋｅ－ｘｉａｎ２， ＺＨＥＮＧ Ｊｉｎ－ｌｏｎｇ２， ＷＡＮＧ Ｘｉｕ－ｌｉ１

（１．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Bｉｏｌｏｇｉｃａｌ Eｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Cｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｌｉｎ Uｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Tｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ

２．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＴＡＳ，Ｈａｉｋｏｕ ５７１１０１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： To ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌly ectract ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Agave sisalana perr.ex Engelm ， ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｎｏ． ＪＭＺ－Ｎ０６ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｗｉｃｅ ｓｃｒｅｅｎ ｆｒｏｍ ｈｕｎｄｒｅｄｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍal ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｌｅｖｅｌｓ and ｆｏｕｒ ｆａｃｔｏｒｓ including ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ， ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Agave sisalana perr.ex Engelm ｗａｓ １４２．５ ｍｇ／ｇ ｗｈｅｎ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ６０ ｈ ｕｎｄｅｒ ３２ ℃ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ １∶２０（g∶mL） ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ６．０.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Agave sisalana perr.ex Engelm； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

劍麻（Agave sisalana perr.ex Engelm）又名鳳尾蘭，是生產(chǎn)硬質(zhì)纖維的主要經(jīng)濟(jì)作物，由于劍麻葉片中纖維的含量?jī)H占其本身的３％～５％，因此在劍麻纖維的加工過(guò)程中將產(chǎn)生大量的廢棄物，如抽取纖維后產(chǎn)生的麻渣、麻汁，劍麻纖維加工過(guò)程中產(chǎn)生的麻糠、麻頭等。這些廢棄物中含有豐富的皂苷、果膠、葉綠素和纖維素，若將其直接排放或堆放，不僅導(dǎo)致大量資源的浪費(fèi)，而且會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染［１］。劍麻皂苷具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、止血、抗衰老、降血糖和保肝等多種活性［２－５］，被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、藥品等諸多領(lǐng)域。劍麻皂苷主要包括兩部分即糖和苷元，分子結(jié)構(gòu)如圖１（Ｒ為糖），有５種單體結(jié)構(gòu)Ｄｏｎｇｓａｐｏｎｉｎ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ［６－８］，平均相對(duì)分子質(zhì)量為１ ２０９．８。

傳統(tǒng)的皂苷分離提取方法主要有溶劑法、酸堿沉淀法、超聲萃取法、超臨界萃取法和生物工程發(fā)酵法。溶劑法局限性是提取分離有效組分的量以及純化的程度都較低。酸堿沉淀法局限性是單相酸水解條件劇烈，常伴有脫水、構(gòu)型變化等。超聲萃取法能夠避免高溫高壓對(duì)有效成分的破壞，但其對(duì)容器壁厚薄和容器的擺放位置有很高的要求。超臨界萃取法對(duì)物料有較好的滲透性和較強(qiáng)的溶解能力，對(duì) 物料某些成分的提取具有更高的效率，但是皂苷類化合物的分子量大、羥基多、極性大，需要加大壓力和加入適當(dāng)?shù)脑噭﹣?lái)提高萃取產(chǎn)率。生物工程發(fā)酵法是通過(guò)加入菌株加速植物細(xì)胞壁的破除釋放出有效成分［９］，從而降低提取難度，可減少原料、化工試劑，節(jié)約動(dòng)力和勞力，減少環(huán)境污染［１０］。

１材料與方法

１．１材料與試劑

１．１．１菌種來(lái)源從廣西桂林市周邊山地采集到幾百份土壤樣品，從中篩選。

１．１．２主要試劑劍麻皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品（９８％，ＨＰＬＣ純，上海研生生物技術(shù)有限公司），劍麻殘?jiān)◤V西劍麻集團(tuán)），ＤＮＳ試劑：２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ（２６２ ｍＬ）與３，５－二硝基水楊酸（６．３０ ｇ）混合加入５００ ｍＬ的熱水溶液中（含１８２ ｇ的酒石酸鉀鈉），再加入苯酚５．００ ｇ及亞硫酸鈉５．００ ｇ，待溶解完全，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至１ Ｌ，貯存于棕色試劑瓶中，室溫放置１０～１５ ｄ即可使用。

１．１．３培養(yǎng)基ＰＤＡ培養(yǎng)基：馬鈴薯２００．００ ｇ，葡萄糖２０．００ ｇ，瓊脂粉１５．００ ｇ，加水至１ Ｌ；木聚糖培養(yǎng)基：馬鈴薯２００．００ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，瓊脂粉１５．００ ｇ，加水至１ Ｌ；篩選平板培養(yǎng)基：ＮａＮＯ３ ３．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５０ ｇ，ＫＣｌ ０．５０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，瓊脂１５．００ ｇ，加水至１ Ｌ；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：ＮａＮＯ３ ３．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５０ ｇ，ＫＣｌ ０．５０ ｇ， ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，加水至１ Ｌ；種子培養(yǎng)基：ＮａＮＯ３ ２．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５０ ｇ，ＫＣｌ ０．５０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，葡萄糖３．００ ｇ，木聚糖２．００ ｇ，加水至１ Ｌ；產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖５．００ ｇ，蛋白胨６．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，ＫＣｌ ０．０５ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，木聚糖２０．００ ｇ，加水至１ Ｌ。

１．１．４儀器Ｃａｒｙ５０型紫外可見光分光光度計(jì)（美國(guó)ＶＡＲＩＡＮ公司），ＳＨＺ－Ｄ（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市子華儀器有限公司），手提式高壓滅菌器（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司），ＤＺＦ－６０５０型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），ＬＲＨ－１５０－Ｚ（Ⅱ）型微電腦控制振蕩培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）。

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１菌種初篩無(wú)菌水浸泡劍麻麻渣２４ ｈ，紗布過(guò)濾，濾液備用。取土壤樣品１０ ｇ，放入盛有１００ ｍＬ麻渣濾液三角瓶中。３０ ℃ １６０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)２４ ｈ，取該土壤稀釋液５ ｍＬ離心，上清液涂布于篩選平板上，３０ ℃下恒溫培養(yǎng)，挑選單菌落進(jìn)一步復(fù)篩。

１．２．２菌種復(fù)篩將初篩的菌株在ＰＤＡ液體培養(yǎng)基中純化，加入到種子培養(yǎng)基中，３０ ℃下培養(yǎng)３２ ｈ備用。

分別精密量?。埃埃?、０．２０、０．４０、０．６０、０．８０、１．００、１．２０、１．４０、１．６０ ｍＬ葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（母液濃度１ ｍｇ／ｍＬ），加入２５ ｍＬ具塞比色管中，編號(hào) ０～８。加去離子水補(bǔ)足至２．００ ｍＬ，加入１．５０ ｍＬ ＤＮＳ 試劑，沸水中顯色５ ｍｉｎ，冷卻至室溫后，加去離子水定容至２５ ｍＬ，充分混勻，在波長(zhǎng)５４０ｎｍ處檢測(cè)ＯＤ５４０ nm。以還原糖的含量ｘ（ｍｇ）對(duì)光密度Ｙ進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Ｙ＝０．１２８ｘ－０．０２０，ｒ＝０．９９９ 0，濃度范圍１０～７０ μｇ／ｍＬ。

１．２．３ＤＮＳ 法測(cè)定菌體發(fā)酵還原糖的能力取備用菌液３０ ｍＬ離心４ ５００ ｒ／ｍｉｎ，１５ ｍｉｎ，收集菌體，加入到２％木聚糖的ＰＤＡ培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)４８ ｈ，離心４ ５００ ｒ／ｍｉｎ，１５ ｍｉｎ，取上清液，制備成還原糖提取液，ＤＮＳ法檢測(cè)提取液中還原糖的含量。

１．２．４菌株生長(zhǎng)曲線的繪制以１０％的接種量，將培養(yǎng)３ ｄ種子菌液接種到產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，２５ ℃、１４０ ｒ／ｍｉｎ搖瓶培養(yǎng)，間隔２ ｈ檢測(cè)發(fā)酵液的ＯＤ５６０ nm，繪制發(fā)酵液中生物量、菌體與光密度的曲線。

１．２．５劍麻皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作制備皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱量劍麻皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品５．００ ｍｇ，用甲醇溶解并定容至５ ｍＬ，分別吸?。埃?、０．４、０．６、０．８和１．０ ｍＬ置２５ ｍＬ具塞試管中，以空白管作對(duì)照，在７０ ℃下烘干后冷卻至室溫。各管中依次加入５％香草醛冰醋酸０．２ ｍＬ，高氯酸０．８ ｍＬ，搖勻后置于７０ ℃烘箱中加熱１５ ｍｉｎ，取出后迅速流水冷卻至室溫，再分別加入５ ｍＬ冰醋酸，搖勻，于４５０ ｎｍ處測(cè)定光密度值ＯＤ４５０ ｎｍ。以含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

１．３高產(chǎn)菌株發(fā)酵劍麻皂苷條件優(yōu)化

選取料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液酸堿度４個(gè)因素，通過(guò)麻渣中皂苷的提取率確定其適宜的發(fā)酵條件［１１－１４］。

１．３．１料液比對(duì)提取率的影響活化的種子菌液３０ ｍＬ，４ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，取沉淀備用。加入１００ ｍＬ無(wú)菌水稀釋，制備８支稀釋菌液，每４支一組。第一組滅活菌體１～４支作對(duì)照，兩組試管分別加入５、１０、１５、２０ ｇ麻渣，標(biāo)記號(hào)１～４和５～８。２８ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養(yǎng)４８ ｈ，取發(fā)酵液５ ｍＬ，４ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，取上清液，吸取１００ μＬ，對(duì)應(yīng)標(biāo)記１～８，真空干燥箱中烘干。其余同皂苷檢測(cè)。

１．３．２發(fā)酵時(shí)間對(duì)提取率的影響種子菌液３０ ｍＬ，４ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，取沉淀備用。稱?。?ｇ麻渣于１００ ｍＬ無(wú)菌水中，菌體加入麻渣料液中，１６０ ｒ／ｍｉｎ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在１２、２４、３６、４８、６０、７２ ｈ時(shí)取發(fā)酵液離心，上清液１００ μＬ干燥，其余同皂苷檢測(cè)。

１．３．３發(fā)酵溫度對(duì)提取率的影響稱?。?ｇ麻渣于１００ ｍＬ無(wú)菌水中，分別置于２４、２６、２８、３０、３２和３４ ℃下１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養(yǎng)４８ ｈ，將發(fā)酵液離心，取上清液１００ μＬ干燥，其余同皂苷檢測(cè)。

１．３．４發(fā)酵液初始ｐＨ對(duì)總皂苷提取率的影響稱取５ ｇ麻渣于１００ ｍＬ無(wú)菌水中。３０ ｍＬ種子菌液４ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，沉淀菌體加入麻渣料液中，調(diào)整發(fā)酵液ｐＨ依次為 ３、４、５、６、７和８，１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養(yǎng)４８ ｈ，將發(fā)酵液離心，取上清液１００ μＬ干燥，其余同皂苷檢測(cè)。

１．３．５正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)以上單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比（Ａ）、發(fā)酵時(shí)間（Ｂ）、發(fā)酵溫度（Ｃ）、發(fā)酵液初始ｐＨ（Ｄ）為試驗(yàn)因素，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Ｌ９（３４）進(jìn)行試驗(yàn)，以劍麻總皂苷的提取量為考察指標(biāo)，進(jìn)行提取工藝的優(yōu)選［１５］。因素與水平見表１。

１．３．６劍麻總皂苷提取工藝的穩(wěn)定性按照正交試驗(yàn)選擇的最優(yōu)條件，重復(fù)皂苷的提取試驗(yàn)，評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果［１６］。

２結(jié)果與分析

２．１ＪＭＺ－Ｎ０６菌株的篩選獲得

由圖２可知，該菌株平板培養(yǎng)時(shí)菌落表面光滑；光學(xué)顯微鏡下呈短棒形態(tài)；透射電鏡下無(wú)鞭毛，長(zhǎng)寬比２∶１。

２．２復(fù)篩

由表２可知，該菌株對(duì)木聚糖有較高的降解能力。因此該菌加速劍麻麻渣中木聚糖向單糖的降解，從而有利于麻渣中皂苷的釋放，達(dá)到提高得率的目的。菌株有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

２．３菌株繁殖生長(zhǎng)

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，也是細(xì)菌生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一定波長(zhǎng)下菌液的光密度表示菌量。由圖３可知，培養(yǎng)３２ ｈ時(shí)，種子菌體吸光值達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)發(fā)酵液中菌體活性最高，代謝活動(dòng)最旺盛。

２．４劍麻皂苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)得劍麻皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為ｙ＝１．４１６ｘ＋０．０４２ ７，R2＝０．９９８ 0，在０．１～０．７ ｍｇ范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（圖4）。根據(jù)劍麻皂苷的5種單體結(jié)構(gòu)計(jì)算得出劍麻總皂苷的相對(duì)分子質(zhì)量為１ ２０９．８，即得劍麻總皂苷的量Ｍ（ｍｇ）與光密度對(duì)應(yīng)方程為Ｍ＝（ｙ－０．０４２ ７）×２．９０／１．４１６ ０。

２．５料液比對(duì)劍麻總皂苷提取率的影響

由表３可知，菌液接種量一定的情況下，１００ ｍＬ發(fā)酵液中加入的麻渣質(zhì)量在１～５ ｇ時(shí)，皂苷的提取量隨著麻渣質(zhì)量的增加而明顯增大，當(dāng)麻渣加入量超過(guò)５ ｇ時(shí)，其麻渣中總皂苷的提取率隨著麻渣質(zhì)量的增加而逐漸減小。

２．６發(fā)酵時(shí)間對(duì)劍麻總皂苷提取率的影響

由表４可知，發(fā)酵１２～４８ ｈ時(shí)，皂苷的提取率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，之后略減小，可見在發(fā)酵４８ ｈ時(shí)總皂苷提取率最大。

２．７發(fā)酵溫度對(duì)劍麻總皂苷提取率的影響

由表５可知，２４～３０ ℃時(shí)，隨著溫度的上升總皂苷提取率明顯增加，之后提取率反而下降，溫度越高劍麻總皂苷提取量越低。

２．８發(fā)酵液初始ｐＨ對(duì)劍麻總皂苷提取率的影響

由表６可知，初始ｐＨ為５．０時(shí)總皂苷的提取量達(dá)到最大值，當(dāng)ｐＨ超過(guò)５．０時(shí)總皂苷提取率又迅速減少。

２．９正交試驗(yàn)結(jié)果

由表７中極差的直觀分析法 Ｒ值可以看出，因素Ｂ的極差最大，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間對(duì)總皂苷提取率的影響最大，其次是因素Ｄ和Ｃ，料液比對(duì)總皂苷提取率的影響最小。所以這４個(gè)因素對(duì)皂苷提取的影響由大到小的順序依次為Ｂ、Ｄ、Ｃ、Ａ。由表７可知，劍麻總皂苷提取發(fā)酵最佳工藝條件為Ａ２Ｂ３Ｃ３Ｄ２，即料液比１∶２０（１ Ｌ發(fā)酵液中加入麻渣５０ ｇ），發(fā)酵時(shí)間６０ ｈ，發(fā)酵溫度３２ ℃，發(fā)酵液初始ｐＨ ６．０。

４結(jié)論

本試驗(yàn)篩選１株ＪＭＺ－Ｎ０６，用于劍麻總皂苷的提取。以總皂苷提取量為指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選，最佳工藝條件為料液比１∶２０（g:mL），發(fā)酵時(shí)間４８ ｈ，發(fā)酵溫度３２ ℃，發(fā)酵液初始ｐＨ ６．０。通過(guò)生物工程發(fā)酵法降解麻渣，降低了提取難度，使含有豐富皂苷資源的廢棄物變廢為寶可以實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 宋發(fā)軍．甾體藥物源植物薯蕷屬植物中薯蕷皂苷元的研究及生產(chǎn)狀況［Ｊ］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，２００２，１４（３）：８９－９０．

［２］ 劉祖文，田長(zhǎng)順，王遵堯．印染廢水處理方法及發(fā)展趨勢(shì)［Ｊ］．科技廣場(chǎng)，２００８（２）：６８－７０．

［３］ 孫 迅，任少亭，畢瑞明，等．粗毛栓菌降解麥草木質(zhì)纖維素的試驗(yàn)研究［Ｊ］．微生物學(xué)雜志，２００２，22（1）：24-26.

［４］ 鄭琳穎，潘競(jìng)鏘，呂俊華．白芍總苷對(duì)脂肪肝大鼠增強(qiáng)胰島素敏感性及抗脂肪肝作用［Ｊ］．中國(guó)中藥雜志，２００８，３３（２０）：３３８５－３３８８．

［５］ 胡巢鳳，陸大祥，孫麗萍，等．人參莖葉皂苷對(duì)小鼠脂肪肝的作用及機(jī)制研究［Ｊ］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，２００９，２５（５）：６６３－６６７．

［６］ ＹＩ Ｄ，ＲＵＩＨＵＡ Ｔ，ＣＨＯＮＧＲＥＮ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｔｗｏ ｎｅｗ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｒｉｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｌｅａｆ－ｊｕｉｃｅｓ ｏｆ Ａｇａｖｅ ｓｉｓａｌａｎａｆｏｒｍ Ｄｏｎｇ Ｎｏ．１［Ｊ］．Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ，１９９３，４１（３）：５５７－５６０．

［７］ ＹＩ Ｄ，ＲＵＩＨＵＡ Ｔ，ＣＨＯＮＧＲＥＮ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍａ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ Ａｇａｖｅ ｓｉｓａｌａｎａ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９， ２８（１０）：２７８７－２７９１．

［８］ ＢＥＲＮＡＲＤＯ Ｄ Ｒ，ＺＡＲＵＲ ＣＯＥＬＨＯ Ｍ Ａ，ＭＡＲＲＵＣＨＯ Ｉ Ｍ． Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｉｓａｌ（Ａｇａｖｅｓｉｓａｌａｎａ）ａｎｄ ｊｕá （Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｏａｚｅｉｒｏ）ｗｉｔｈ ｃｈｏｌｉｎｉｕｍ－ｂａｓｅｄ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ ａｎｄ ｄｅｅｐ ｅｕｔｅｃｔｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，２３７（６）：９６５－９７５．

［９］ ＳＡＮ ＬＡ，ＫＵＮ ＤＵＲＫ， ＤＵＢＥＳ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｊａｐｏｎｉｃａｓ ＩＩ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ［Ｊ］． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９８８，１０（２）：９１－９９．

［１０］ 鄧楚津，聶芳紅．超臨界ＣＯ２萃取劍麻中總皂苷的工藝研究［Ｊ］． 食品研究與開發(fā)，２００８，２９（２）：４１－４３．

［１１］ 湯興利，徐增萊，夏冰，等．盾葉薯蕷皂素提取工藝及檢測(cè)方法研究進(jìn)展［Ｊ］．中藥材，２００４，２７（１１）：８７７－８７９．

［１２］ 程雅楠，陳鴻漢，劉菲．利用正交法分離鑒定苯胺降解菌及對(duì)其降解特性的研究［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１１，３９（１５）：９００２－９００４．

［１３］ 陳鋆，劉振香，吳昌勝．苦瓜中提取苦瓜皂苷的工藝研究［Ｊ］． 廣州化工，２０１０，３８（１）：６１．

［１４］ 廖春芳，藍(lán)碧鋒．還原糖法測(cè)定中性纖維素酶活力的不確定度評(píng)定［Ｊ］．農(nóng)產(chǎn)品加工，２０１２（４）：１２２－１２４．

［１５］ 魏效玲，薛冰軍，趙強(qiáng)．基于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的多指標(biāo)優(yōu)化方法研究［Ｊ］．河北工程大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２０１０，２７（３）：９６－９９．

［１６］ 黃蓉姿，萬(wàn)金泉，馬邕文，等．正交實(shí)驗(yàn)選擇纖維素酶產(chǎn)生菌的最優(yōu)綜合培養(yǎng)條件［Ｊ］．中國(guó)環(huán)境科學(xué),2012,32（1）：130-135.

參考文獻(xiàn)：

［１］ 宋發(fā)軍．甾體藥物源植物薯蕷屬植物中薯蕷皂苷元的研究及生產(chǎn)狀況［Ｊ］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，２００２，１４（３）：８９－９０．

［２］ 劉祖文，田長(zhǎng)順，王遵堯．印染廢水處理方法及發(fā)展趨勢(shì)［Ｊ］．科技廣場(chǎng)，２００８（２）：６８－７０．

［３］ 孫 迅，任少亭，畢瑞明，等．粗毛栓菌降解麥草木質(zhì)纖維素的試驗(yàn)研究［Ｊ］．微生物學(xué)雜志，２００２，22（1）：24-26.

［４］ 鄭琳穎，潘競(jìng)鏘，呂俊華．白芍總苷對(duì)脂肪肝大鼠增強(qiáng)胰島素敏感性及抗脂肪肝作用［Ｊ］．中國(guó)中藥雜志，２００８，３３（２０）：３３８５－３３８８．

［５］ 胡巢鳳，陸大祥，孫麗萍，等．人參莖葉皂苷對(duì)小鼠脂肪肝的作用及機(jī)制研究［Ｊ］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，２００９，２５（５）：６６３－６６７．

［６］ ＹＩ Ｄ，ＲＵＩＨＵＡ Ｔ，ＣＨＯＮＧＲＥＮ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｔｗｏ ｎｅｗ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｒｉｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｌｅａｆ－ｊｕｉｃｅｓ ｏｆ Ａｇａｖｅ ｓｉｓａｌａｎａｆｏｒｍ Ｄｏｎｇ Ｎｏ．１［Ｊ］．Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ，１９９３，４１（３）：５５７－５６０．

［７］ ＹＩ Ｄ，ＲＵＩＨＵＡ Ｔ，ＣＨＯＮＧＲＥＮ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍａ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ Ａｇａｖｅ ｓｉｓａｌａｎａ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９， ２８（１０）：２７８７－２７９１．

［８］ ＢＥＲＮＡＲＤＯ Ｄ Ｒ，ＺＡＲＵＲ ＣＯＥＬＨＯ Ｍ Ａ，ＭＡＲＲＵＣＨＯ Ｉ Ｍ． Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｉｓａｌ（Ａｇａｖｅｓｉｓａｌａｎａ）ａｎｄ ｊｕá （Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｏａｚｅｉｒｏ）ｗｉｔｈ ｃｈｏｌｉｎｉｕｍ－ｂａｓｅｄ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ ａｎｄ ｄｅｅｐ ｅｕｔｅｃｔｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，２３７（６）：９６５－９７５．

［９］ ＳＡＮ ＬＡ，ＫＵＮ ＤＵＲＫ， ＤＵＢＥＳ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｊａｐｏｎｉｃａｓ ＩＩ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ［Ｊ］． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９８８，１０（２）：９１－９９．

［１０］ 鄧楚津，聶芳紅．超臨界ＣＯ２萃取劍麻中總皂苷的工藝研究［Ｊ］． 食品研究與開發(fā)，２００８，２９（２）：４１－４３．

［１１］ 湯興利，徐增萊，夏冰，等．盾葉薯蕷皂素提取工藝及檢測(cè)方法研究進(jìn)展［Ｊ］．中藥材，２００４，２７（１１）：８７７－８７９．

［１２］ 程雅楠，陳鴻漢，劉菲．利用正交法分離鑒定苯胺降解菌及對(duì)其降解特性的研究［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１１，３９（１５）：９００２－９００４．

［１３］ 陳鋆，劉振香，吳昌勝．苦瓜中提取苦瓜皂苷的工藝研究［Ｊ］． 廣州化工，２０１０，３８（１）：６１．

［１４］ 廖春芳，藍(lán)碧鋒．還原糖法測(cè)定中性纖維素酶活力的不確定度評(píng)定［Ｊ］．農(nóng)產(chǎn)品加工，２０１２（４）：１２２－１２４．

［１５］ 魏效玲，薛冰軍，趙強(qiáng)．基于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的多指標(biāo)優(yōu)化方法研究［Ｊ］．河北工程大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２０１０，２７（３）：９６－９９．

［１６］ 黃蓉姿，萬(wàn)金泉，馬邕文，等．正交實(shí)驗(yàn)選擇纖維素酶產(chǎn)生菌的最優(yōu)綜合培養(yǎng)條件［Ｊ］．中國(guó)環(huán)境科學(xué),2012,32（1）：130-135.

參考文獻(xiàn)：

［１］ 宋發(fā)軍．甾體藥物源植物薯蕷屬植物中薯蕷皂苷元的研究及生產(chǎn)狀況［Ｊ］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，２００２，１４（３）：８９－９０．

［２］ 劉祖文，田長(zhǎng)順，王遵堯．印染廢水處理方法及發(fā)展趨勢(shì)［Ｊ］．科技廣場(chǎng)，２００８（２）：６８－７０．

［３］ 孫 迅，任少亭，畢瑞明，等．粗毛栓菌降解麥草木質(zhì)纖維素的試驗(yàn)研究［Ｊ］．微生物學(xué)雜志，２００２，22（1）：24-26.

［４］ 鄭琳穎，潘競(jìng)鏘，呂俊華．白芍總苷對(duì)脂肪肝大鼠增強(qiáng)胰島素敏感性及抗脂肪肝作用［Ｊ］．中國(guó)中藥雜志，２００８，３３（２０）：３３８５－３３８８．

［５］ 胡巢鳳，陸大祥，孫麗萍，等．人參莖葉皂苷對(duì)小鼠脂肪肝的作用及機(jī)制研究［Ｊ］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，２００９，２５（５）：６６３－６６７．

［６］ ＹＩ Ｄ，ＲＵＩＨＵＡ Ｔ，ＣＨＯＮＧＲＥＮ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｔｗｏ ｎｅｗ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｒｉｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｌｅａｆ－ｊｕｉｃｅｓ ｏｆ Ａｇａｖｅ ｓｉｓａｌａｎａｆｏｒｍ Ｄｏｎｇ Ｎｏ．１［Ｊ］．Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ，１９９３，４１（３）：５５７－５６０．

［７］ ＹＩ Ｄ，ＲＵＩＨＵＡ Ｔ，ＣＨＯＮＧＲＥＮ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍａ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ Ａｇａｖｅ ｓｉｓａｌａｎａ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９， ２８（１０）：２７８７－２７９１．

［８］ ＢＥＲＮＡＲＤＯ Ｄ Ｒ，ＺＡＲＵＲ ＣＯＥＬＨＯ Ｍ Ａ，ＭＡＲＲＵＣＨＯ Ｉ Ｍ． Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｉｓａｌ（Ａｇａｖｅｓｉｓａｌａｎａ）ａｎｄ ｊｕá （Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｏａｚｅｉｒｏ）ｗｉｔｈ ｃｈｏｌｉｎｉｕｍ－ｂａｓｅｄ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ ａｎｄ ｄｅｅｐ ｅｕｔｅｃｔｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，２３７（６）：９６５－９７５．

［９］ ＳＡＮ ＬＡ，ＫＵＮ ＤＵＲＫ， ＤＵＢＥＳ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｊａｐｏｎｉｃａｓ ＩＩ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ［Ｊ］． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９８８，１０（２）：９１－９９．

［１０］ 鄧楚津，聶芳紅．超臨界ＣＯ２萃取劍麻中總皂苷的工藝研究［Ｊ］． 食品研究與開發(fā)，２００８，２９（２）：４１－４３．

［１１］ 湯興利，徐增萊，夏冰，等．盾葉薯蕷皂素提取工藝及檢測(cè)方法研究進(jìn)展［Ｊ］．中藥材，２００４，２７（１１）：８７７－８７９．

［１２］ 程雅楠，陳鴻漢，劉菲．利用正交法分離鑒定苯胺降解菌及對(duì)其降解特性的研究［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１１，３９（１５）：９００２－９００４．

［１３］ 陳鋆，劉振香，吳昌勝．苦瓜中提取苦瓜皂苷的工藝研究［Ｊ］． 廣州化工，２０１０，３８（１）：６１．

［１４］ 廖春芳，藍(lán)碧鋒．還原糖法測(cè)定中性纖維素酶活力的不確定度評(píng)定［Ｊ］．農(nóng)產(chǎn)品加工，２０１２（４）：１２２－１２４．

［１５］ 魏效玲，薛冰軍，趙強(qiáng)．基于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的多指標(biāo)優(yōu)化方法研究［Ｊ］．河北工程大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２０１０，２７（３）：９６－９９．

［１６］ 黃蓉姿，萬(wàn)金泉，馬邕文，等．正交實(shí)驗(yàn)選擇纖維素酶產(chǎn)生菌的最優(yōu)綜合培養(yǎng)條件［Ｊ］．中國(guó)環(huán)境科學(xué),2012,32（1）：130-135.