劉笑然， 黃鑫炎， 林耿鵬， 譚衛(wèi)平， 劉揚麗， 謝燦茂△

(1海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院急診科， 海南 ?？?570102; 2中山大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 廣東 廣州 510080)

β-腎上腺素受體(β-adrenergic receptor， βAR)是一種7次穿膜的受體。βAR家族包括β1AR、β2AR和β3AR 3個亞型[1]，其經(jīng)典途經(jīng)是通過G蛋白增加細胞內(nèi)的cAMP水平，激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)，使下游各靶位點(如NF-κB)磷酸化，調(diào)控細胞各項生理活動。小鼠體內(nèi)淋巴組織中的T細胞和B細胞均有β2AR表達，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、遷移等功能。用6-羥多巴胺封閉DBA/2小鼠T細胞的β2AR，細胞增殖速度明顯增加[2]。 也有學者發(fā)現(xiàn)βAR調(diào)節(jié)細胞遷移，腎上腺素可增加循環(huán)中淋巴細胞的數(shù)量，給予βAR阻滯劑后淋巴細胞的數(shù)量下降[3-4]。體內(nèi)注入異丙腎上腺素或腎上腺素，能增加小鼠脾臟中淋巴細胞外流的數(shù)量[5]。將小鼠淋巴細胞用熒光標記，并用異丙腎上腺素預處理15 min后注入小鼠體內(nèi)，標記的淋巴細胞較多地分布在脾臟或外周淋巴結(jié)中[6]。另有資料顯示： CD34+干細胞能表達β2AR[7]，其激動劑調(diào)節(jié)細胞遷移[8]。交感神經(jīng)通過β2AR途徑促進細胞遷移，β2AR激動劑加速細胞遷移，但慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)患者外周血中的早期內(nèi)皮祖細胞(early endothelial progenitor cells, early-EPCs)是否表達β2AR及其對細胞遷移的影響如何，目前尚無報道。

材 料 和 方 法

1 病例的來源和選擇

從來自25例已戒煙的COPD患者及16例年齡、性別無差異的志愿者外周血中分離CD34+細胞。所有實驗均得到海南醫(yī)學院倫理委員會的同意。

患者入組標準：(1)中、重度COPD(GOLD stages 2～4)；(2)穩(wěn)定期(研究前4周內(nèi)肺功能無變化或無惡化)；(3)休息時PO2>60 mmHg；(4)年齡<70歲；(5)近2周內(nèi)無全身性應用激素治療。 排除標準：(1)有原發(fā)性心血管病，如原發(fā)性高血壓、腦血管疾病、心律失常等；(2)影響外周血液干細胞數(shù)量的疾病，如腫瘤性疾病、腎臟疾病、風濕性疾??；(3)糖尿病及其它代謝性疾病。對照組入選標準：(1)年齡<70歲；(2)肺功能正常；(3)沒有臨床癥狀；(4)無吸煙史。

2 實驗細胞的制備和鑒定

2.1CD34+細胞的分離提純 將20 mL靜脈血按1∶1用Hanks液稀釋，用1.077的Ficoll梯度分離液分離血中的單個核細胞；將5×107個細胞懸浮于100 μL 試劑中，按100 μL抗體1 mL細胞懸液的比例，加入EasySep?抗體混合物(例如，在2 mL細胞懸液中加入200 μL 抗體混合液)，用移液器上下吹打充分混勻，室溫孵育15 min。

用移液器上下吹打EasySep?納米磁珠5 次以上，以確保磁珠均勻一致(不使用渦旋震蕩器)；按50 μL 磁珠1 mL 細胞懸液的比例，加入磁珠，充分吹打混勻，室溫孵育10 min； 用EasySep?緩沖液將細胞懸液的體積調(diào)整至2.50 mL(<5×108cells)，用移液器上下輕輕吹打2～3次，混勻細胞。將試管插入磁極中，靜置5 min。將磁鐵及試管一起拿起，以連續(xù)緩慢的動作傾倒磁極至倒置狀態(tài)，倒出上清部分。保持磁極及試管倒置2～3 s，然后使試管口恢復向上的位置。從磁極中取出試管，加入2.50 mL(<5×108cells)EasySep?緩沖液。用移液器輕輕吹打細胞懸液2～3次，混勻細胞。將試管放回磁鐵中，靜置5 min。重復上述步驟，在磁極中的分選過程共4次，每次5 min。從磁極中取出試管，加入適量試劑重懸細胞，得到所需的CD34+細胞并用流式細胞術分析。

2.2檢測內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs) 將CD34+細胞種植在有內(nèi)皮細胞基礎培養(yǎng)基2(endothelial basal medium-2,EBM-2)的6孔板中，48 h后，去除不貼壁的細胞，將貼壁細胞用胰酶消化，加入2% BSA孵育30 min，之后加入mAb-CD34-FITC、mAb-CD133-PE及Ⅰ抗mouse anti-human VEGFR2，孵育40 min，再加入Ⅱ抗rabbit anti-mouse APC，20 min后用流式細胞術檢測。獲得80%表達的EPCs用于本實驗研究。CD34+的細胞懸浮液用PBS液加入1% FCS，用2% BSA封閉。

2.3細胞的傳代 EPCs為貼壁生長細胞。把經(jīng)密度梯度離心、磁珠正分選的CD34+細胞均勻種植在3%明膠包被的6孔培養(yǎng)板中，至細胞單層鋪滿培養(yǎng)皿時，即需分殖至新的培養(yǎng)皿中，一般大概需要10 d左右。 吸掉舊培養(yǎng)基，用無菌1×PBS 1 mL輕輕洗滌細胞1次，加入0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化液1 mL(1 mL/直徑10 cm培養(yǎng)皿)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中作用1～2 min，輕拍培養(yǎng)皿使細胞脫落。于顯微鏡下觀察，細胞呈現(xiàn)圓粒狀。將洗脫下來的細胞轉(zhuǎn)移至有4 mL EBM-2全培養(yǎng)液的15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄除離心后的上清液，再次加入4 mL EBM-2全培養(yǎng)液，充分吹打混勻細胞和培養(yǎng)液。取新的6孔培養(yǎng)板，加入2～3 mL EBM-2全培養(yǎng)液，取細胞液約0.3 mL加入培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.4細胞標記 取原液(1 g/L)40 μL加入2 mL EBM-2全培養(yǎng)液中；取1×106EPCs加入放有上述培養(yǎng)基的6孔板中，放入5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中6 h。取出培養(yǎng)板，吸除培養(yǎng)基，用Hanks液輕輕沖洗3次，每次5 min。用 4%多聚甲醛固定細胞10 min。 固定后用Hanks液沖洗1次 ，將 FITC-UEA-I(10 mg/L)加入上述標本中在5% CO2、 37 ℃下孵育 1 h。熒光顯微鏡鑒定 FITC-UEA-I 和 DiI-acLDL 雙染色陽性細胞為正在分化的 early-EPCs。整個過程避光進行。Early-EPCs主要表達CD34、CD133和VEGFR2，細胞形態(tài)呈大頭釘狀，一般是在培養(yǎng)的第4～7天出現(xiàn)。

3 β2AR在early-EPCs表達的檢測

3.1RT-PCR法測定β2AR mRNA的表達 (1) 細胞總RNA的提?。杭毎糜?.5 mL Eppendorf 管，加入Trizol 1 mL裂解細胞提取總RNA，經(jīng)氯仿/異丙醇純化和75%乙醇沉淀，真空干燥后加DEPC處理水溶解RNA，加入2.5倍體積乙醇，置-80 ℃保存。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應：取4 μL RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應，MMLV體系，總反應體積20 μL；反應條件：37 ℃ 1 h，然后95 ℃ 3 min。(3) 定性PCR擴增：用Primer Express 2.0 軟件設計引物，β2AR上游引物5’-CGC TTC CAT GTC CAG AAC CT-3’，下游引物5’-TCT TGA GGG CTT TGT GCT CC-3’，擴增片段長度為 106 bp；內(nèi)參照基因β-actin上游引物5’-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3’，下游引物5’-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3’， 擴增片段長度為106 bp。PCR反應條件為：93 ℃ 5 min；然后93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

3.2Western blotting法檢測β2AR蛋白的表達 (1)提取細胞膜蛋白：收集對數(shù)生長期的細胞至15 mL離心管，加1 mL RIPA裂解液充分混勻，用超聲波細胞破碎儀粉碎裂解細胞(10 s×3次)，12 000×g、4 ℃離心30 min，取上清-80 ℃保存；BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，用細胞裂解液調(diào)整使各樣本蛋白濃度一致；(2)SDS-PAGE ：按配方灌制分離膠和濃縮膠，在調(diào)整好濃度的各樣本蛋白中加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min，立即冰上冷卻，4 ℃、15 000×g離心1 min，取上清液，用微量加樣器按10 μg待測樣品/孔上樣， 60 mA 電泳30 min，90 mA 60 min；(3)免疫印跡操作：30 V、4 ℃過夜電轉(zhuǎn)膜， 將PVDF膜室溫下封閉1 h，分別將β2AR和β-actin 的PVDF膜裝入透明塑料袋中，分別按照 1∶400和1∶2 000用2 mL封閉液稀釋鼠抗人β2AR Ⅰ抗及兔抗人β-actin Ⅰ抗，搖床上緩慢搖動，4 ℃過夜； 將PVDF膜分別浸入1∶5 000封閉液稀釋的抗鼠和抗兔HRP標記的Ⅱ抗中，置搖床上緩慢搖動，室溫下孵育40 min； ECL試劑顯影，暗室曝光約20 min，沖洗膠片，應用彩色圖像攝錄輸入儀及全自動圖像分析儀Multi-Gauge 3.0軟件分析蛋白條帶密度值，以β-actin作為內(nèi)參照，計算蛋白相對表達水平。

3.3熒光染色和流式細胞術測定β2AR的表達 (1)Early-EPCs(1× 105)用2% BSA封閉30 min，加入鼠抗mAb-β2AR孵育40 min，再加入兔抗鼠IgE-PE，室溫孵育40 min，同時加入DAPI(5 mg/L)20 min，用PBS清洗2次，放在倒置熒光顯微鏡下觀察。(2)Early-EPCs(1× 105)用2% BSA封閉30 min后，加入鼠抗人mAb-β2AR Ⅰ抗，孵育40 min后，再加入山羊抗鼠IgE-APC Ⅱ抗孵育 30 min，用PBS清洗2次，每次5 min，流式細胞術檢測。

4 Transwell實驗檢測early-EPCs的遷移能力

用含0.1% FCS的EBM-2培養(yǎng)基調(diào)整細胞數(shù)，以每孔3×104early-EPCs/200 μL加入Transwell上室中，下室加入0.1% FCS 的EBM-2培養(yǎng)基 500 μL 及100 μg/L 基質(zhì)細胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor 1α,SDF-1α)。細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，2 h 后收集下室的細胞并計數(shù)。

5 siRNA的轉(zhuǎn)染步驟

用LipofectamineTM2000 (Lip02000)于24孔細胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)染siRNA。轉(zhuǎn)染前1 d，接種適當數(shù)量的細胞至細胞培養(yǎng)板中，每孔中加入無抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度能夠達到30%～50%匯合度；對于每個轉(zhuǎn)染樣品，按如下步驟準備siRNA-Lipo2000混合液： 用 50 μL不含血清的培養(yǎng)基 Opti-MEM?Ⅰ(v2) 稀釋 25 pmol siRNA(加入細胞中的 RNA終濃度為50 nmol/L)，輕輕混勻，室溫孵育5 min；用50 μL不含血清的培養(yǎng)基Opti-MEM? I (v2) 稀釋1 μL Lipo2000，輕輕混勻并室溫孵育 5 min； 將兩者輕輕混勻，室溫孵育 20 min。將siRNA-Lipo2000混合液加入含有細胞以及培養(yǎng)液 (v1) 的培養(yǎng)板各孔中，輕輕混勻，置于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24～96 h。培養(yǎng) 4～6 h 后，將孔里含有siRNA-Lipo2000混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮的生長培養(yǎng)基。

6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理，兩組間均數(shù)比較采用配對t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 細胞培養(yǎng) early-EPCs的形態(tài)

顯微鏡下觀察early-EPCs形似淋巴細胞，核大，胞漿少，呈集落樣生長。EPCs為貼壁細胞，接種后24 h基本全部貼壁生長，大概10 d后細胞在培養(yǎng)皿中長成梭狀致密單層，已基本上飽和，需要傳代，見圖1。

Figure 1. Culture and identification of early-EPCs. A: a colony of early-EPCs in COPD group after 48 h of culture (×20); B: early-EPCs were simultaneously labeled with DiI-acLDL (red) and UEA-1-FITC after 10 d of culture (×40).

2 β2AR mRNA及蛋白在early-EPCs的表達

COPD組和對照組early-EPCs，不加入逆轉(zhuǎn)錄酶者，未檢到 β2AR 和 β-actin 條帶，說明實驗用的mRNA沒有基因組DNA的污染。加入逆轉(zhuǎn)錄酶者的目的條帶283 bp處均可見特異性β2AR mRNA表達,COPD組細胞 β2AR mRNA的表達強于對照組細胞，見圖2A。COPD組和對照組的 early-EPCs 均可檢出分子量約為56～85 kD的 β2AR 蛋白條帶。經(jīng)圖像分析軟件分析，以β-actin標準化后的COPD組early-EPCs 其β2AR蛋白表達強度高于對照組細胞(P<0.05)，見圖2B。用流式細胞術觀察可見COPD組和對照組的 early-EPCs均有 β2AR表達，其陽性率分別為82.9%和55.7%，見圖2C。

Figure 2. β2AR were expressed on the early-EPCs from the peripheral blood of COPD patients or control subjects. A: β2AR mRNA in early-EPCs from the COPD patients and the control subjects were detected by RT-PCR as gel electropherogram and quantification; B: the protein levels of β2AR in the early-EPCs from the COPD patients and the control subjects were determined by Western blotting; C: the expression of β2AR in the early-EPCs were analyzed by FACS in COPD group and control group. Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control.

3 β2AR在early-EPCs的分布

在熒光顯微鏡下對COPD組和對照組的 early-EPCs進行觀察，可見兩組細胞均表達 β2AR。COPD組 β2AR 的熒光強度明顯高于對照組，呈現(xiàn)兩極分布，見圖3。

Figure 3. Distribution of β2AR in the early-EPCs of COPD patients or control subjects(×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control.

4 ICI118551和去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)對early-EPCs遷移功能的影響

為了減少多次實驗對結(jié)果的影響，空白對照組采用同一實驗得出的結(jié)果。

4.1不同濃度的ICI118551對early-EPCs遷移的影響 COPD組及對照組的early-EPCs分別與ICI118551(0、5、10、15 nmol/L)孵育24 h后，經(jīng)過2 h遷移，下室細胞計數(shù)表明，COPD組遷移的細胞數(shù)明顯少于對照各組(P<0.05)。當ICI118551 為10 nmol/L時，COPD組與對照組的遷移細胞數(shù)沒有明顯差異(P>0.05),見圖4。

4.2不同濃度的NE對early-EPCs遷移的影響 COPD組及對照組的early-EPCs分別與不同濃度的NE(0、50、100、150 nmol/L)在37 ℃、5% CO2孵育24 h后，經(jīng)過2 h遷移，可見隨著NE的濃度升高，抑制細胞遷移的效應增強，見圖5。

Figure 4. Number of migratory early-EPCs treated with ICI118551 at different concentrations (0,5,10 and 15 nmol/L) for 24 h.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; △P<0.05 vs COPD at baseline concentration (0 nmol/L).

Figure 5. Number of migratory early-EPCs treated with NE at different concentrations (50, 100 and 150 nmol/L) for 24 h.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; △P<0.05 vs COPD at baseline concentration (0 nmol/L).

5 β2AR單克隆抗體(monoclonal antibody of β2AR,mAb-β2AR)對early-EPCs遷移的影響

5.1不同濃度的mAb-β2AR對early-EPCs遷移的影響 COPD組及對照組的early-EPCs分別與不同濃度的mAb-β2AR(0、1∶100、1∶150、1∶250和1∶300)在37 ℃、5% CO2孵育24 h后，經(jīng)過2 h遷移，行下室細胞計數(shù)，可見用mAb-β2AR封閉細胞的β2AR有助于提高細胞的遷移能力，且mAb-β2AR的濃度是1∶250時，兩組的遷移細胞數(shù)量無明顯差別(P>0.05),見圖6。

Figure 6. Number of migratory early-EPCs treated with mAb-β2AR at different concentrations (1∶100, 1∶150, 1∶250 and 1∶300) for 24 h.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; △P<0.05 vs COPD at baseline concentration (0).

5.2mAb-β2AR與ICI118551和NE共同作用下對early-EPCs遷移的影響 將COPD組及對照組的early-EPCs先與mAb-β2AR(1∶250)共同孵育40 min (37 ℃、5% CO2)后，再與ICI118551(10 nmol/L)或NE(100 nmol/L)共同孵育24 h，經(jīng)2 h遷移，行下室細胞計數(shù)，可見COPD組不同處理組與對照組之間的細胞遷移數(shù)之間無明顯差異(P>0.05)，在COPD組之間的細胞遷移數(shù)也無明顯差異(P>0.05)，見圖7。

6 RNA干擾下調(diào)β2AR在early-EPCs的表達對細胞遷移的影響

經(jīng)72 h 轉(zhuǎn)染siRNA(轉(zhuǎn)染率70%)，收集細胞，在Transwell上室培養(yǎng)2 h 后收集下室的細胞并計數(shù),發(fā)現(xiàn)COPD組下調(diào)β2AR表達后，其early-EPCs的遷移能力得到改善，見圖8。

討 論

本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，COPD組的early-EPCs β2AR mRNA表達強于對照組。Western blotting結(jié)果示：以β-actin標準化后，COPD組細胞的β2AR蛋白表達強度明顯高于對照組(P<0.05)。流式細胞術檢測COPD組及對照組的early-EPCs 其β2AR的表達分別為82.9%和55.7%。COPD組的early-EPCs對SDF-1α遷移的細胞數(shù)量明顯少于對照組(P<0.05)。應用不同濃度的β2AR阻滯劑ICI 118551 作用于COPD組的early-EPCs 24 h，COPD組的early-EPCs對SDF-1α(100 μg/L)遷移的數(shù)量均有所提高，其中當 ICI118551 濃度達10 nmol/L時，細胞遷

Figure 7. Effects of mAb-β2AR (1∶250) combined with NE (100 nmol/L) or ICI118551 (10 nmol/L) on the migration of early-EPCs.Mean±SD.n=6.

Figure 8. Effect of knockdown of β2AR expression by RNA interference on the migration of the early-EPCs to SDF-1α.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; △P<0.05 vs COPD.

移數(shù)量增加最明顯(P<0.05)。將COPD組的early-EPCs與不同濃度NE共同孵育24 h 后，細胞的遷移數(shù)量均不同程度地減少，與NE濃度呈負相關。β2AR抗體可使COPD組的early-EPCs遷移細胞數(shù)增加。將COPD組的early-EPCs與mAb-β2AR (1∶250)孵育40 min 之后，再分別與β2AR激動劑(NE 100 nmol/L)、阻滯劑 ICI118551 (10 nmol/L)作用，各組間的遷移細胞數(shù)無明顯差異。這表明β2AR被抗體封閉后，細胞遷移受到影響。通過下調(diào)β2AR的表達，能增加細胞的遷移能力。

β2AR是一種廣泛分布在人體組織的腎上腺能受體，調(diào)節(jié)著機體多種生理功能。β2AR在交感神經(jīng)作用下，調(diào)節(jié)細胞遷移和增殖[9]。有研究顯示[7,10]，β2AR激動劑加速細胞遷移，在一定程度上抑制細胞增殖，改變β2AR的表達將影響細胞的增殖和遷移功能[11-12]。骨髓內(nèi)表達CD34+的干細胞歸巢受交感神經(jīng)調(diào)節(jié)[7-8]。幼稚CD34+干細胞表達β2AR，通過β2AR激活，使細胞膜金屬基質(zhì)蛋白酶活化，分泌金屬蛋白酶，引起骨髓微環(huán)境中起抑制外流作用的基質(zhì)膜破壞，促進CD34+干細胞外流。應用相應受體阻滯劑，細胞的外流過程受到抑制。β2AR可在交感神經(jīng)作用下，促進T淋巴細胞遷移，β2AR激動劑可加速細胞遷移[7, 10]。本實驗發(fā)現(xiàn)：在COPD組的外周EPCs上有β2AR表達，明顯高于對照組，其遷移能力較低，與過高β2AR表達有關，應用β2AR抗體、阻滯劑后，EPCs的遷移功能有所改善，這與Goncharova等[13]報道的關于β2AR 激動劑能選擇性抑制HASM細胞的遷移，長期應用β2AR激動劑對細胞遷移的抑制作用降低的結(jié)果相一致。當應用β2AR抗體封閉β2AR時，再給于β2AR激動劑或阻滯劑處理，細胞的遷移數(shù)量無明顯差異，進一步說明β2AR表達對COPD組的early-EPCs的遷移起著非常重要作用，且與β2AR的密度改變有關。而COPD組急性發(fā)作期血漿中去甲腎上腺素水平增高[14]，加之治療期間患者間斷應用β2AR激動劑，可能會通過改變β2AR的功能變化，進而影響early-EPCs的遷移功能。另外，COPD組血漿中的細胞因子及毒素(TNF-α、IL-1、LPS)能改變細胞上β2AR的表達，改變細胞的遷移能力[15-16]。

因此，我們推測COPD組的呼吸系統(tǒng)反復發(fā)生炎癥反應，引起肺組織中細胞因子水平增高，當外周血中的EPCs進入肺組織，在肺內(nèi)“停留”，部分細胞因子及外源性β2AR激動劑可能會改變EPCs上β2AR的表達數(shù)量與受體活性，造成COPD組的EPCs上β2AR mRNA及蛋白的表達水平明顯高于對照組，干擾EPCs由肺組織向外周血中進一步遷移，造成外周血中細胞數(shù)量降低，同時通過β2AR數(shù)量或活性變化導致下游受體活性異常，激活相應信號通路，造成EPCs遷移功能異常，受損血管內(nèi)皮處的EPCs數(shù)量下降，影響修復，導致血管內(nèi)皮功能異常，加速動脈硬化，促進COPD患者心血管疾病發(fā)病率升高[17-18]。

本研究的意義在于，應用β2AR阻滯劑或抗體能夠提高COPD患者外周血中early-EPCs遷移功能。通過基因干擾技術下調(diào)COPD組early-EPCs的β2AR表達，可改善細胞遷移能力，將為臨床上預防COPD患者心血管疾病的發(fā)生提供理論依據(jù)。但β2AR是如何改變COPD患者血中EPCs遷移能力，仍需進一步研究。

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