趙嚴冬， 劉潘虹， 李學敏， 魯 凡， 王華東， 陸大祥， 戚仁斌△

(1暨南大學醫(yī)學院病理生理學系， 2國家中醫(yī)藥管理局病理生理實驗室， 3暨南大學附屬第一醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510632)

缺血缺氧性腦病是老年人的常見病和多發(fā)病，患者腦部血液循環(huán)受阻，局部組織缺血缺氧，引起神經(jīng)元丟失最終導致神經(jīng)功能缺失。目前研究認為，缺血缺氧性腦病引起的神經(jīng)元遲發(fā)性死亡(delayed neuronal death)以凋亡為主[1]。缺血再灌注損傷是大多數(shù)缺血缺氧性腦病發(fā)病的主要機制，其中誘導神經(jīng)元凋亡的主要因素包括氧化應(yīng)激[2]、炎癥反應(yīng)[3]、細胞內(nèi)鈣超載以及線粒體損傷[4]等。

遠志(polygala)是一種遠志屬遠志科多年生草本植物，是我國常用的益智中草藥，在益智、抗衰老、抗氧化等方面顯示出獨特的藥理活性[5]。本課題組前期通過東莨菪堿所致小鼠學習記憶障礙模型、快速老化系SAM/P-8小鼠和AD細胞模型，對中藥組方Q0409進行研究，發(fā)現(xiàn)遠志的主要單體成分遠志皂苷元(senegenin，Sen)是發(fā)揮神經(jīng)保護作用的主要單體成分之一[6]。本研究擬采用原代神經(jīng)元缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)誘導凋亡的細胞模型，對Sen抗H/R誘導的神經(jīng)細胞凋亡作用及其機制進行初步探討，為Sen防治相關(guān)疾病提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物

新生24 h內(nèi)健康Sprague-Dawley大鼠乳鼠，SPF級，雌雄不限，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2011-0015，合格證編碼為No.4402101641。

2 主要試劑

遠志皂苷元購自中國生物藥品檢驗所；DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM/HG培養(yǎng)基購自Hyclone；Neurobasal培養(yǎng)基、B27購自Gibco；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、PBS緩沖液購自HyClone；胰蛋白酶粉和青、鏈霉素雙抗購自北京普博欣公司；厭氧產(chǎn)氣劑購自日本三菱公司；厭氧培養(yǎng)袋購自法國梅里埃公司；Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、SDS-PAGE凝膠試劑盒、5×上樣緩沖液、BCA定量試劑盒購自碧云天公司；GAPDH、SAPK/JNK、phospho-SAPK/JNK、c-Jun、phospho-c-Jun、Bax和Bcl-2抗體購自Cell Signaling Technology；大鼠神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)抗體、PVDF膜購自Millipore；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1原代大鼠皮層神經(jīng)元的分離培養(yǎng) 用75% 乙醇消毒新生鼠頭部后放入超凈工作臺內(nèi)，無菌條件下依次剝離皮膚、顱骨，分離出大腦組織置于預冷的PBS磷酸鹽緩沖液中，用眼科彎鑷分離出皮層組織，小心去除腦膜和血管，收集入含 2 mL DMEM/F12培養(yǎng)基的小玻璃瓶中，用眼科剪快速將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm左右組織塊。以上步驟均在4 ℃條件下(冰袋上面)進行。將剪碎的組織轉(zhuǎn)移至裝有DMEM/F12配制的0.125%胰蛋白酶消化瓶中，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化10 min，隔5 min搖勻1次，使之充分消化。向消化瓶內(nèi)加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用尖端拋光的玻璃管輕輕吹打至無可見的組織塊。將懸液通過200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液移至15 mL離心管，4 ℃、1 200 r/min離心5 min后棄去上清液，加入neurobasal完全培養(yǎng)基(含2% B27)，用尖端拋光的玻璃管輕輕吹打數(shù)次。取10 μL細胞懸液鏡下計數(shù)，將細胞密度調(diào)為2×1010/L ，接種于0.25 g/L多聚賴氨酸提前包被的培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種4 h后，用neurobasal完全培養(yǎng)基(含2% B27)全換液。繼續(xù)培養(yǎng)至6 d，每隔2 d用neurobasal完全培養(yǎng)基(含2% B27)進行半換液。

3.2MAP-2免疫熒光染色鑒定原代神經(jīng)元 棄去原培養(yǎng)基，用復溫PBS靜孵清洗3次，每次5 min。用4%多聚甲醛溶液室溫固定神經(jīng)元20 min。PBS洗細胞3次，每次5 min。用0.3% Triton X-100(300 μL Trion X-100+100 mL 5%山羊血清)室溫處理細胞15 min。PBS清洗3次，每次5 min。用5%山羊血清室溫封閉1 h。用抗體稀釋液將MAP-2按1∶200的比例稀釋, 滴于細胞爬片的細胞面，并將整個24孔板放入濕盒里，4℃孵育過夜。去除Ⅰ抗，用PBS洗細胞3次，每次5 min。FITC-辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG用抗體稀釋液按1∶200的比例稀釋，室溫避光孵育1 h。用1∶200比例稀釋Hoechst 33342 染核。用PBS洗細胞3次，每次5 min。在細胞爬片上滴加抗熒光淬滅液，熒光顯微鏡下觀察拍照。

3.3實驗分組 (1)正常對照組(control組)：無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)15 h；(2) 模型組(H/R組)：缺氧液無氧條件下培養(yǎng)12 h后添加等量無血清DMEM/HG培養(yǎng)液常氧培養(yǎng)3 h；(3) Sen保護處理組(Sen+H/R組)：含60 μmol/L Sen的缺氧液無氧條件下培養(yǎng)12 h后，添加等量含60 μmol/L Sen無血清DMEM/HG培養(yǎng)液常氧培養(yǎng)3 h；(4) Sen處理組(Sen組)：含60 μmol/L Sen的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)15 h。

3.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 6孔板培養(yǎng)細胞，按照上述實驗分組進行實驗。達到作用時間后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，每次5 min。每孔加入0.25%胰酶1 mL，放入37 ℃培養(yǎng)箱1～2 min左右，輕輕并且迅速地吹打細胞使之懸浮于消化液中，然后加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。待細胞消化完全后，轉(zhuǎn)移入5 mL離心管中分組標記，配平并放入4 ℃離心機中，1 000 r/min離心5 min。輕輕吸去上清，在各組中加入binding buffer 200 μL，槍頭吹打成單細胞懸液。避光條件下先后加入annexin V-FITC染料和PI染料各2 μL，孵育15 min。輕輕吹打混勻后，上機檢測各組細胞凋亡率，作為造模的質(zhì)量監(jiān)控。

3.5Western blotting免疫印跡法檢測JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bcl-2和Bax的蛋白表達的變化 造模成功后，進行蛋白提取。棄去原培養(yǎng)基，用預冷PBS洗2次。每孔按比例加入細胞裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF(RIPA∶PMSF=100∶1)，冰上裂解40 min(每10 min用細胞刮刮1次)，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清液，用BCA試劑盒進行蛋白定量后，將各組的蛋白濃度調(diào)成一致。向蛋白上清液內(nèi)加入相應(yīng)比例5×上樣緩沖液，沸水浴5 min后立即置于-80 ℃冰箱保存。使用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離所得蛋白(GADPH作為內(nèi)參照)，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下用合適的封閉液(5% 脫脂奶粉或者5% BSA)輕搖封閉PVDF膜1 h后，1×TBST洗膜3次，每次5 min。再分別加入相應(yīng)Ⅰ抗(Ⅰ抗稀釋液按說明書以適當濃度稀釋)于4 ℃孵育過夜。取出PVDF膜，用1×TBST洗3次，每次10 min。加入相應(yīng)的Ⅱ抗(1×TBST 按說明書以適當濃度稀釋)，室溫孵育1 h后，1×TBST洗3次，每次10 min。用ECL發(fā)光液以及顯影液、定影液發(fā)光顯色，將膜上的蛋白印跡轉(zhuǎn)移到膠片上，并且進行灰度掃描。實驗重復3次。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)法進行統(tǒng)計學分析：各組方差齊性時，兩兩比較采用LSD法；各組方差不齊性時，兩兩比較采用Tamhane’s T2法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 大鼠大腦皮層原代神經(jīng)元鑒定

新生大鼠皮質(zhì)原代神經(jīng)元采用含2% B27的無血清neurobasal完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，以減少膠質(zhì)細胞的影響。培養(yǎng)6 d后，用神經(jīng)元特異性抗體MAP-2免疫熒光染色法對皮層神經(jīng)元進行鑒定，結(jié)果見圖1。使用免疫熒光的方法將FITC標記的Ⅱ抗與Ⅰ抗結(jié)合，并在 488 nm的激發(fā)光激發(fā)下，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞綠色熒光的分布情況，同時用Hoechst 33342 染細胞核。藍色熒光標記的是細胞核，綠色熒光標記的是MAP-2。細胞中神經(jīng)元的數(shù)量占細胞總數(shù)的80%以上，可用于后續(xù)實驗，見圖1。

Figure 1. Immunocytochemical identification of cultured primary cortical neurons at DIV6 with anti-MAP-2 antibody (green) marker.A: Hoechst 33342; B: MAP-2; C: Merged. Scale bar=50 μm.

2 Annexin V-PI雙染流式細胞術(shù)檢測皮層神經(jīng)元凋亡率

圖2顯示流式細胞術(shù)檢測各組神經(jīng)元凋亡率，control組和Sen組的凋亡率分別為6.9%、9.7%；H/R組凋亡率顯著增加，達29.2%；H/R+Sen組細胞凋亡率低于H/R組，僅為11.4%。由表1可見，control組和Sen組的凋亡率分別為(8.5±2.9)%、(11.5±1.9)%；與control組比較，H/R組凋亡率顯著增加，達(29.1±3.9)%(P<0.05)；H/R+Sen組細胞凋亡率則顯著低于H/R組[(14.1±3.4)%,P<0.05]。這一結(jié)果提示Sen可對抗H/R誘導的皮層神經(jīng)元凋亡，造模成功。

3 Sen抗H/R誘導皮層神經(jīng)元凋亡對JNK蛋白及下游信號通路的影響

3.1對JNK蛋白表達及磷酸化的影響 由圖3可見，與control組(0.42±0.05)相比，H/R組JNK蛋白表達顯著減少(0.32±0.10，P<0.05)；與H/R組相比，H/R+Sen 組JNK蛋白表達顯著增加(0.49±0.06，P<0.05)。同時，與control 組(0.26±0.15)相比，H/R組p-JNK蛋白表達顯著增加(0.31±0.19，P<0.05);與H/R組相比，H/R+Sen 組p-JNK蛋白表達顯著減少(0.24±0.08，P<0.05)。與control 組p-JNK/JNK(0.64±0.10)相比，H/R組p-JNK/JNK比值顯著升高(0.98±0.14,P<0.05)；與H/R組相比，H/R+Sen 組p-JNK/JNK比值顯著降低(0.63±0.15,P<0.05)。

Figure 2. The effect of Sen on the H/R-induced apoptosis of primary cortical neurons examined by flow cytometry. The representative results of 3 independent experiments were shown.

表1 遠志皂苷元對H/R損傷誘導的神經(jīng)元凋亡的影響

3.2對c-Jun蛋白表達及磷酸化的影響 由圖4可見，與control 組(0.39±0.14)相比，H/R組c-Jun蛋白表達顯著減少(0.32±0.06，P<0.05)；與H/R組相比，H/R+Sen 組c-Jun蛋白表達顯著增加(0.41±0.05，P<0.05)。同時，與control 組(0.22±0.05)相比， H/R組p-c-Jun蛋白表達顯著增加(0.33±0.26，P<0.05)。與H/R組相比，H/R+Sen 組p-c-Jun蛋白表達顯著減少(0.25±0.05，P<0.05)。以control 組p-c-Jun/c-Jun為標準值進行比較，H/R組p-c-Jun/c-Jun相對值顯著升高(1.20±0.14,P<0.05)；與H/R組相比，H/R+Sen 組p-c-Jun/c-Jun相對值顯著降低(0.84±0.19,P<0.05)。

Figure 3. The effects of Sen on JNK expression and the phosphorylation of JNK in H/R-induced primary cortical neurons. Mean±SEM. n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs H/R.

Figure 4. The effects of Sen on c-Jun expression and the phosphorylation of c-Jun in H/R-induced primary cortical neurons. Mean±SEM. n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs H/R.

3.3Sen抗H/R誘導皮層神經(jīng)元凋亡對Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 由圖5可見，與 control 組(Bcl-2 1.21±0.14， Bax 0.53±0.17)相比， H/R組Bcl-2蛋白表達顯著減少(0.56±0.14，P<0.05)，Bax蛋白表達顯著增加(1.15±0.50，P<0.05)。與H/R組相比，H/R+Sen 組Bcl-2蛋白表達顯著增加(0.79±0.20，P<0.05)，Bax的蛋白表達顯著減少(0.59±0.17，P<0.05)。

Figure 5. The effects of Sen on the expression of Bax and Bcl-2 in H/R-induced primary cortical neurons. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs H/R.

討 論

已有研究證實，神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元丟失多是由于凋亡信號通路被激活后誘發(fā)凋亡所致[7]。我們先前的研究以H/R損傷誘導的PC12細胞凋亡模型，證實Sen可對抗H/R誘導的PC12細胞凋亡，其機制可能是通過抑制NADPH氧化酶活化，減少活性氧生成，降低[Ca2+]i，維持線粒體膜電位，最終抑制caspase-3的活化[8]。本研究擬在先前研究基礎(chǔ)上，通過建立原代皮層神經(jīng)元的H/R模型，模擬神經(jīng)元凋亡過程，在原代皮層神經(jīng)元上研究Sen抗細胞凋亡的作用及對相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路的影響。

有研究發(fā)現(xiàn)[9]，在小腦顆粒神經(jīng)元H/R模型中，神經(jīng)元凋亡率升高與JNK的磷酸化增加有關(guān)。Koga等[10]在對神經(jīng)母細胞瘤H/R模型的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達MKP-1可以抑制JNK的磷酸化，抑制凋亡基因的表達，從而減少H/R模型中神經(jīng)細胞的凋亡；而沉默MKP-1基因可以升高JNK的磷酸化水平，最終導致神經(jīng)細胞凋亡增加。此結(jié)果提示了JNK參與神經(jīng)細胞凋亡過程的調(diào)節(jié)，并且其磷酸化水平與神經(jīng)細胞凋亡率有關(guān)。Zhao等[11]在對神經(jīng)細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷可以活化Cdc42，促進Cdc42-MLK復合體的形成及JNK信號通路的激活，而選擇性敲低Cdc42可抑制MLK3-MKK7-JNK級聯(lián)反應(yīng)，阻滯c-Jun的磷酸化及FasL 的表達、Cyt C的釋放及caspase-3的活化，減輕再灌注后神經(jīng)細胞凋亡等，提示c-Jun磷酸化水平亦與神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。此外，Relja等[12]在對肝細胞H/R模型的研究中發(fā)現(xiàn)，H/R模型中Bcl-2表達水平明顯降低；Liu等[13]采用Zea-Longa法構(gòu)建大鼠缺血再灌注模型，通過在不同時點對各組大鼠進行行為學檢測并且通過免疫組化和TUNEL法檢測海馬不同區(qū)域caspase-3、Bcl-2和Bax 表達情況發(fā)現(xiàn)，模型組行為學發(fā)生改變，caspase-3表達增加，Bcl-2表達減少而Bax表達增加，說明腦缺血/再灌注損傷可能會導致神經(jīng)損傷，導致動物行為學的改變，且神經(jīng)元凋亡可能與caspase-3、Bcl-2及Bax的表達水平相關(guān)；Gao等[14]在白藜蘆醇對抗短暫性糖氧剝奪損傷發(fā)揮神經(jīng)元保護作用的研究中也證實了Bcl-2表達下調(diào)和Bax表達上調(diào)在神經(jīng)元凋亡中的重要作用。Lei 等[15]研究顯示，Bcl-2家族蛋白也可能參與到依賴JNK的凋亡信號通路中：Bcl-2表達增加后，JNK誘導的凋亡會受到抑制；而JNK基因敲除細胞在受到損傷時，Bcl-2則不表達。Zhai等[16]最近研究表明，抑制JNK磷酸化可上調(diào)Bax表達，進而減少細胞凋亡的發(fā)生。這些結(jié)果證實了Bcl-2及相關(guān)蛋白在細胞凋亡的JNK信號通路中扮演了相當重要的角色。因此，本研究建立原代皮層神經(jīng)元的H/R凋亡模型，重點觀察了在該模型中Sen對凋亡相關(guān)信號通路中JNK和c-Jun蛋白表達及其磷酸化，以及Bcl-2和Bax的蛋白表達的影響。

首先，我們采用免疫熒光法(神經(jīng)元特異性蛋白MAP-2抗體)鑒定分離培養(yǎng)的大鼠原代皮層細胞，結(jié)果顯示培養(yǎng)的細胞為皮層神經(jīng)元，純度達到80%以上(圖1)。在后續(xù)造模實驗中，為確保所收集的樣本具有代表性，我們收集一部分細胞，通過Annexin-V/PI雙染法并進行流式細胞術(shù)實驗檢測細胞凋亡率，以作為后續(xù)蛋白組學實驗的質(zhì)控指標。流式結(jié)果(表1)顯示H/R組細胞凋亡率顯著高于正常對照組和Sen組，而H/R+Sen組細胞凋亡則顯著低于H/R組，提示模型構(gòu)建成功，可用于蛋白提取并進行后續(xù)實驗。接著，我們采用Western blotting法檢測各凋亡相關(guān)蛋白的表達水平。實驗結(jié)果(圖3～5)顯示：(1)H/R組的JNK和c-Jun的蛋白表達水平均顯著低于control組；與H/R組比較，H/R+Sen組的JNK和c-Jun的蛋白表達水平顯著升高；(2) H/R組的JNK和c-Jun磷酸化水平均高于control組；與H/R組比較，H/R+Sen組的JNK和c-Jun磷酸化水平均顯著降低；(3) H/R組的Bcl-2水平顯著低于control組，同時Bax水平顯著高于control組；與H/R組比較，H/R+Sen組Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax蛋白表達水平顯著降低。這一結(jié)果初步證實Sen對抗H/R誘導神經(jīng)細胞凋亡、發(fā)揮細胞保護作用的機制可能是通過上調(diào)JNK及c-Jun的表達并抑制其磷酸化，進而上調(diào)下游信號蛋白Bcl-2的表達和下調(diào)Bax的表達，最終抑制H/R誘導的原代神經(jīng)元的凋亡。然而，Sen的藥理作用及其深入的機制還有待進一步研究。

[參 考 文 獻]

[1] Shinoda Nl, Moriguchi S, Shirasaki Y, et al. Generation of constitutively active calcineurin by calpain contributes to delayed neuronal death following mouse brain ischemia[J]. J Neurochem, 2006, 98(1):310-320.

[2] Chen H, Yoshioka H, Kim GS, et al. Oxiadative stress in ischemic brain damage: mechanisms of cell death and potential molecular targets for neuroprotection[J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 14(8):1505-1517.

[3] Ma M, Uekawa K, Hasegawa Y, et al. Pretreatment with rosuvastatin protects against focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats through attenuation of oxidative stress and inflammation[J]. Brain Res, 2013, 1519:87-94.

[4] Eltzschig HK, Eckle T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation[J]. Nat Med, 2011, 17(11):1391-1401.

[5] 劉大偉, 康利平, 馬百平. 遠志化學及藥理作用研究進展[J]. 國際藥學研究雜志, 2012, 39(1):32-36.

[6] 戚仁斌. 中藥Q0409防治學習記憶障礙的作用及機制研究[D]. 廣州：暨南大學，2007.

[7] Wines-Samuelson M, Schulte EC, Smith MJ, et al. Characterization of age-dependent and progressive cortical neuronal degeneration in presenilin conditional mutant mice[J]. PLoS One, 2010, 5(4):e10195.

[8] 紀惜鑾. 遠志皂苷元對缺氧/復氧誘導PC12細胞損傷的作用及機制[D]. 廣州：暨南大學，2010.

[9] Liu AL, Wang XW, Liu AH, et al. JNK and p38 were involved in hypoxia and reoxygenation-induced apoptosis of cultured rat cerebellar granule neurons[J]. Exp Toxicol Pathol, 2009, 61(2):137-143.

[10] Koga S, Kojima S, Kishimoto T, et al. Over-expression of map kinase phosphatase-1 (MKP-1) suppresses neuronal death through regulating JNK signaling in hypoxia/re-oxygenation[J]. Brain Res, 2012, 1436:137-146.

[11] Zhao J, Pei DS, Zhang QG, et al. Down-regulation Cdc42 attenuates neuronal apoptosis through inhibiting MLK3/JNK3 cascade during ischemic reperfusion in rat hippocampus[J]. Cell Signal, 2007, 19(4):831-843.

[12] Relja B, T?ttel E, Breig L, et al. Plant polyphenols attenuate hepatic injury after hemorrhage/resuscitation by inhibition of apoptosis, oxidative stress, and inflammation via NF-κB in rats[J]. Eur J Nutr, 2012, 51(3):311-321.

[13] Liu G, Wang T, Wang T, et al. Effects of apoptosis-related proteins caspase-3, Bax and Bcl-2 on cerebral ischemia rats[J]. Biomed Rep, 2013, 1(6):861-867.

[14] Gao D, Huang T, Jiang X, et al. Resveratrol protects primary cortical neuron cultures from transient oxygen-glucose deprivation by inhibiting MMP-9[J]. Mol Med Rep, 2014, 9(6):2197-2204.

[15] Lei K, Nimnual A, Zong WX, et al. The Bax subfamily of Bcl2-related proteins is essential for apoptotic signal transduction by c-Jun NH2-terminal kinase[J]. Mol Cell Biol, 2002, 22(13):4929-4942.

[16] Zhai CL, Zhang MQ, Zhang Y, et al. Glycyrrhizin protects rat heart against ischemia-reperfusion injury through blockade of HMGB1-dependent phospho-JNK/Bax pathway[J]. Acta Pharmacol Sin, 2012, 33(12):1477-1487.