翟長(zhǎng)文 王紓宜

（復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院病理科 上海 200032）

EB病毒在原發(fā)性扁桃體彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（PTDLBCL）中的表達(dá)及其臨床意義

翟長(zhǎng)文 王紓宜△

（復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院病理科 上海 200032）

目的探討EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）在原發(fā)性扁桃體彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（primary tonsillar diffuse large B cell lymphoma，PTDLBCL）內(nèi)的感染情況及其臨床病理學(xué)意義。方法采用EBV編碼微小RNA（EBV encoded miRNA，EBERs）原位雜交（in situhybridization，ISH）和 EBV 潛伏膜蛋白1 （latent membrane protein 1，LMP1），PCR檢測(cè)EBV在PTDLBCL（n=81）和原發(fā)性非扁桃體彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（primary nontonsillar diffuse large B cell lymphoma，PNTDLBCL）（n=42）、鼻腔 NK/T細(xì)胞淋巴瘤（n=10）及慢性扁桃體炎（n=20）中的感染情況，并分析差異。結(jié)果ISH結(jié)果顯示，PTDLBCL中EBV的陽性率高于PNTDLBCL（t=5.603，P=0.018）。檢測(cè)PTDLBCL中EBV，PCR陽性率顯著高于ISH （t=11.139，P=0.001）。EBV陽性PTDLBCL者預(yù)后優(yōu)于陰性者 （t=5.683，P=0.017）；與患者年齡、部位及性別的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論EBV在PTDLBCL中高表達(dá)，其存在與患者預(yù)后正相關(guān)。檢測(cè)PTDLBCL的EBV，LMP1 PCR的敏感度高于EBERs ISH，而EBERs ISH的特異度高于LMP1 PCR。

EB病毒（EBV）； 扁桃體； 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）； 預(yù)后； PCR； 原位雜交（ISH）

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是一種侵襲性非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin＇s lymphoma，NHL），常侵犯淋巴結(jié)和淋巴結(jié)外器官或組織，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。口咽部是結(jié)外淋巴瘤的一個(gè)發(fā)病部位，腭扁桃體（以下簡(jiǎn)稱扁桃體）是咽淋巴組織環(huán)惡性淋巴瘤最容易累及的部位之一[1]，在扁桃體內(nèi)淋巴瘤的發(fā)生率僅次于鱗狀細(xì)胞癌，居第2位[2]。

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一種嗜B淋巴細(xì)胞γ-皰疹病毒。目前檢測(cè)EBV感染可采用血清學(xué)、組織學(xué)及基因?qū)W方法。血清學(xué)方法是通過檢測(cè)機(jī)體應(yīng)對(duì)EBV感染產(chǎn)生的特異性抗體明確感染，人群中血清學(xué)檢出率高達(dá)90%，表示曾經(jīng)或正在感染EBV[3]。原位雜交（in situhybridization，ISH）檢測(cè) EBV 編碼微小 RNA（EBV encoded miRNAs，EBERs）是一種敏感、特異的檢測(cè)方法。由于EBERs的穩(wěn)定性及其出現(xiàn)于病毒感染的所有潛伏期，可在福爾馬林固定石蠟包埋（formalinfixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織中明確病毒感染細(xì)胞以及細(xì)胞內(nèi)定位[4-5]。PCR是一種快速、特異的病毒檢測(cè)方法，通過擴(kuò)增EBV潛伏膜蛋白（latent membrane protein1，LMP1）基因，結(jié)合凝膠電泳明確EBV感染。后兩種方法相對(duì)于血清學(xué)檢測(cè)更能反映病變組織與EBV的相關(guān)性。

以往在DLBCL中EBV的檢出率較低，認(rèn)為其發(fā)生與EBV感染無關(guān)或相關(guān)性較低。近年來，隨著研究的深入及檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的研究結(jié)果證實(shí)EBV在DLBCL中有一定的檢出率。扁桃體作為DLBCL的一個(gè)發(fā)病部位，EBV在其內(nèi)的感染情況及其臨床病理學(xué)意義尚未定論。本實(shí)驗(yàn)采用EBERs ISH和LMP1 PCR檢測(cè)EBV在原發(fā)性扁桃體DLBCL（primary tosillar DLBCL，PTDLBCL）中的感染情況并探討其臨床病理學(xué)意義。

資料和方法

病例收集與患者資料收集2009年1月至2012年1月在復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院進(jìn)行活檢或手術(shù)摘除的PTDLBCL的FFPE組織。篩選病變組織較多、能夠進(jìn)行繼續(xù)切片及臨床資料完整的81例行EBERs ISH，選擇其中標(biāo)本量充足的31例行LMP1 PCR檢測(cè)。收集慢性扁桃體炎20例及鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤10例行EBERs ISH及LMP1 PCR。收集復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院2011年1月至2013年1月確診的42例原發(fā)性非扁桃體DLBCL （primary non-tonsillar DLBCL，PNTDLBCL）的FFPE組織。入組患者既往均無免疫缺陷，未接受過免疫抑制治療，無淋巴瘤、自身免疫性疾病病史（表1）。

表1 患者基本臨床資料及生存情況Tah 1 Demographic characteristics and survival situation of patients （n）

實(shí)驗(yàn)方法

EBERs ISH FFPE組織切成3μm/張，按原位雜交試劑盒（泰普生物科技有限公司）的實(shí)驗(yàn)步驟稍作改進(jìn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤為陽性對(duì)照；以PBS代替一抗，為陰性對(duì)照。EBERsISH檢測(cè)以至少一個(gè)腫瘤細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)特異性染色為陽性。重復(fù)實(shí)驗(yàn)排除假陽性結(jié)果。

LMP1 PCR FFPE組織按照臨床樣品基因組DNA微量試劑盒（QIAGEN）操作步驟行DNA抽提。以人β-globin基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)抽提DNA的完整性，上游引物序列為5＇-CAGACACCATGGTGCACCTGAC-3＇，下 游 引 物 序 列 為 5＇-CCAATAGGCAGAGAGAGTCAGTG-3＇，擴(kuò)增 條 帶 長(zhǎng) 度 216 bp。EBV LMP1上游引物序列為5＇-AGCGACTCTGCTGGAAATGAT-3＇，下 游 引 物 序 列 為 5＇-TGATTAGCTAAGGCATTCCCA-3＇，擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度286 bp。PCR反應(yīng)體系20μL，Hot Start聚合酶（TaKaRa DR007A）采用熱啟動(dòng)PCR法進(jìn)行擴(kuò)增。陽性對(duì)照為鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤，陰性對(duì)照為同體積的雙蒸水代替模板。重復(fù)實(shí)驗(yàn)排除假陽性結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0（USA）及Stata 10.0運(yùn)算，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

81例PTDLBCL中，20例EBERs ISH陽性（24.7%），61例陰性（75.3%，圖1）。20例陽性中左側(cè)10例，其中6例男性；右側(cè)10例，其中6例女性。42例PNTDLBCL有3例EBERs ISH陽性。以31例PTDLBCL的FFPE組織抽提液為模板進(jìn)行PCR，均能擴(kuò)增出β-globin，18例LMP1陽性（圖2），左側(cè)8例，其中男性5例；右側(cè)10例，其中女性7例。10例鼻腔NK/T淋巴瘤組織EBERs ISH及LMP1 PCR均呈陽性，20例慢性扁桃體炎中，兩種方法均未檢測(cè)到EBV存在。

圖1 PTDLBCL的組織學(xué)特點(diǎn)和EBERs ISH（×400）Fig 1 Histology and ISH of EBERs in PTDLBCL（×400）A：HE；B：Positive EBERs ISH；C：Negative EBERs ISH；D：Positive EBERs ISH；E：Negative EBERs ISH，tonsillar chronic inflammation；F：Negative EBERs ISH.

圖2 PCR結(jié)果Fig 2 PCR resultA：LMP1 in PTDLBCL；B：β-globin in PTDLBCL.1，2，3，4：Positive PTDLBCL；5：Black control；6：Positive control；7，8：Tonsillar chronic inflammation.

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果LMP1 PCR的敏感度為83.3%，特異度為48%，EBERs ISH的敏感度為27.7%，特異度為92.3%。LMP1 PCR的敏感度高于EBERs ISH，EBERs ISH 的特異度高于LMP1 PCR（表2）。用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，PTDLBCL與PNTDLBCL在EBV陽性率上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.603，P=0.018，表3）；兩種檢測(cè)方法在PTDLBCL中EBV總體陽性率上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.139，P=0.001），31例 PTDLBCL標(biāo)本均行兩種檢測(cè)方法，陽性率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.681，P=0.001）。EBV 表達(dá)與患者預(yù)后正相關(guān) （t=5.683，P=0.017，表 4），EBV 在PTDLBCL中臨床病理學(xué)意義如表5所示。EBV在各年齡組PTDLBCL患者的感染率是相似的，老年患者組并沒有較高的EBV感染率。另外，男女感染EBV的機(jī)會(huì)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是均等的，發(fā)病部位的左右差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 四格表比較31例PTDLBCL患者中兩種檢測(cè)方法Tah 2 Comparison of the two detection methods in the 31 cases of PTDLBCL hy four space form （n）

表3 PTDLBCL與PNTDLBCL中EBERS檢測(cè)率的比較Tah 3 Detection rate of EBERS ISH in PTDLBCL and PNTDLBCL （n）

表4 PTDLBCL的預(yù)后與EBV感染的相關(guān)性Tah 4 Correlation of EBV and patients＇prognisis in PTDLBCL （n）

表5 PTDLBCL的臨床病理特征表5 Clinicopathologic features of PTDLBCL （n）

討 論

咽淋巴組織環(huán)（Waldeyer＇s環(huán)）是一個(gè)特殊的解剖學(xué)部位。扁桃體是 Waldeyer＇s環(huán)內(nèi)最大的器官，是淋巴結(jié)與黏膜相關(guān)淋巴組織相移行的部位[6]。EBV是一種嗜B淋巴細(xì)胞γ-皰疹病毒，參與多種B細(xì)胞腫瘤的發(fā)生，如霍奇金淋巴瘤（Hodgkin＇s lymphoma，HL）、伯 基 特 淋 巴 瘤 （Burkitt＇s lymphoma，BL）及移植后淋巴組織增殖癥等[3，7]。以往EBV在DLBCL中檢出率較低，近年來，隨著研究的深入及檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，已有EBV在DLBCL中的檢出率為6%[8]、8%～10%[9]、15%[10]甚至高達(dá)35.48%[11]的報(bào)道。鑒于EBV在人群中的普遍感染率及扁桃體部位的特殊性，本文意在探討PTDLBCL內(nèi)EBV感染情況。

由于組織樣本量的限制，我們只能在31例PTDLBCL中進(jìn)行PCR擴(kuò)增LMP1。LMP1的PCR檢測(cè)結(jié)果（18/31）與EBERs的ISH檢測(cè)結(jié)果（20/81）之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.139，P=0.001）。在31例PTDLBCL中比較兩種檢測(cè)方法：LMP1 PCR的敏感度較高，EBERs ISH的特異度較高。兩種檢測(cè)方法在結(jié)果上的差異只能從檢測(cè)目標(biāo)物及方法學(xué)上尋求原因。LMP1是EBV潛伏感染產(chǎn)物，具有確切的致瘤作用。在體外，LMP1促進(jìn)B細(xì)胞轉(zhuǎn)化及永生化[12]，它可以通過多種途徑導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[8，13-14]。LMP1可以作為EBV感染轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)志物。LMP1的PCR檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，與EBERs的ISH檢測(cè)相比，需較多的組織樣本量，檢測(cè)費(fèi)用較高，若實(shí)驗(yàn)控制不佳可出現(xiàn)假陽性，臨床實(shí)用性不及ISH。EBERs在EBV潛伏感染的細(xì)胞中表達(dá)豐富，聚集于細(xì)胞核內(nèi)[15]。EBERs表達(dá)水平的上升會(huì)增加細(xì)胞的瘤變性[16]。ISH檢測(cè)EBERs所需組織樣本量少，但并非所有EBV感染的細(xì)胞中都能檢測(cè)到EBERs。EBV相關(guān)的鼻咽癌組織中EBERs的表達(dá)有不均一性[17]，腫瘤細(xì)胞的分裂導(dǎo)致病毒基因丟失使此區(qū)域檢測(cè)不到EBERs[15]。另外組織中與探針有限的結(jié)合位點(diǎn)和探針的滲透性也限制了ISH的敏感度[16]。

慢性扁桃體炎性組織中沒有檢測(cè)到LMP1擴(kuò)增，81例PTDLBCL中EBV的檢出率為24.7%。說明EBV在人群中有較高的普遍感染率，但病毒以不危害宿主的方式存在[18]。在部分患者中，EBV可能對(duì)感染的B細(xì)胞進(jìn)行基因整合，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化進(jìn)而達(dá)到瘤變的目的。EBV基因在受感染細(xì)胞內(nèi)整合與否與其致病密切相關(guān)，這有利于揭示EBV陽性的B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制。

81例PTDLBCL中EBERs ISH陽性率為24.7%，42例PNTDLBCL中EBERs ISH陽性率為7%。EBV在PTDLBCL中的檢出率統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于PNTDLBCL，同時(shí)也高于部分已知研究結(jié)果，我們考慮有以下3個(gè)方面的原因。

首先，關(guān)于DLBCL中EBV的檢出率的報(bào)道涉及全身多個(gè)部位，包括胃腸、肺、睪丸、神經(jīng)系統(tǒng)、扁桃體以及淋巴結(jié)各器官[8-10，19]。彭金昀等[20]驗(yàn)證了DLBCL中EBV的感染存在部位依賴性。扁桃體的特殊解剖位置可能是其內(nèi)有較高EBV檢出率的主要原因：其位于消化道和呼吸道的交匯處，黏膜內(nèi)含有豐富的淋巴組織，是接觸各類病原微生物等抗原的門戶。生發(fā)中心B細(xì)胞隨時(shí)發(fā)生著高頻突變，比其他部位的B細(xì)胞更易于發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變[21]。細(xì)胞因子及其受體在EBV相關(guān)的扁桃體B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生中起一定作用，其中CXCR4、CXCR5和CCR7因EBV感染而表達(dá)上調(diào)[22]。EBV感染后，扁桃體內(nèi)EBV相關(guān)的抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）因病毒IL-10（viral IL-10，vIL-10）的表達(dá)而活性降低[21]。因此，在扁桃體內(nèi)較有利的微環(huán)境下EBV感染的B淋巴細(xì)胞較其他部位更易于存活、接受轉(zhuǎn)化及達(dá)到瘤變。

其次，陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)的不同也可能是陽性率差異的一個(gè)原因。EBERs ISH目前還沒有統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)，有學(xué)者提出至少在一個(gè)腫瘤細(xì)胞核中出現(xiàn)特異性染色即判定為陽性[23]，也有以陽性率≥10%[10]或＞20%[24]為標(biāo)準(zhǔn)。為規(guī)范化比較EBV檢出率，亟需建立統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)。鑒于EBERs ISH較少出現(xiàn)假陽性，特異性較高，同時(shí)參照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，本研究將陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為切片中至少一個(gè)腫瘤細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)特異性染色為陽性。PNTDLBCL內(nèi)EBV檢出率（7%）與文獻(xiàn)相似，說明扁桃體的特殊部位導(dǎo)致的EBV檢測(cè)率差異所占比重較大，尚需加大樣本量來證實(shí)此結(jié)論。

再次，地區(qū)及種族差異也可能是陽性率不同的原因，在亞洲和拉丁美洲D(zhuǎn)LBCL患者中EBV的感染率為9%～15%，在西方國(guó)家約為5%[25]。2008年文亦磊等[11]在研究124例淋巴結(jié)外DLBCL中發(fā)現(xiàn)，EBERs陽性率為35.48%，明顯高于西方國(guó)家及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

EBV在各年齡組PTDLBCL患者中的感染率相似，老年患者組未發(fā)現(xiàn)較高的EBV感染率。男女感染EBV的機(jī)會(huì)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是均等的，發(fā)病部位（左，右）的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

PTDLBCL患者中，EBV陽性者的預(yù)后優(yōu)于陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能由于病毒陽性者與陰性者之間的發(fā)病機(jī)制不同所致。陽性者由于病毒感染，B細(xì)胞發(fā)生基因改變，繼而發(fā)生永生化；而陰性者B細(xì)胞可能在其他因素的作用下發(fā)生腫瘤變。另外，EBV的存在可能會(huì)持續(xù)激發(fā)機(jī)體局部免疫反應(yīng)，趨化各類炎性細(xì)胞及因子的浸潤(rùn)，對(duì)抗病毒感染的同時(shí)應(yīng)對(duì)腫瘤免疫。我們會(huì)繼續(xù)關(guān)注這方面的現(xiàn)象，并致力于其具體原因的研究。

綜上所述，對(duì)于檢測(cè)PTDLBCL組織中EBV的存在，LMP1 PCR的敏感度較高，EBERs ISH的特異度較高。PTDLBCL在EBV感染率上顯著高于PNTDLBCL。EBV的存在與扁桃體DLBCL患者預(yù)后正相關(guān)，與患者發(fā)病年齡、部位及性別的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EBV在扁桃體DLBCL的發(fā)生中如何發(fā)揮作用及其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

致謝復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院病理科提供了PTDLBCL對(duì)照標(biāo)本。復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系給予了技術(shù)上的支持和指導(dǎo)。

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Epstein-harr virus infection in primary tonsillar diffuse large B cell lymphoma（PTDLBCL）and its clinical significance

ZHAI Chang-wen，WANG Shu-yi△
（Department of Pathology，Eyes，Ears，Nose and Throat Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai200032，China）

epstein-barr virus（EBV）； tonsillar； diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）；prognosis； PCR；in situhybridization（ISH）

R 766

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.02.012

2013-05-16；編輯：王蔚）

△Corresponding author E-mail：wangshuyi@eent.shmu.edu.cn

【Ahstract】 OhJectiveTo study the infection of Epstein-Barr virus（EBV）in primary tonsillar diffuse large B cell lymphoma（PTDLBCL）and its clinical significance.MethodsThe infection of EBV in the tissues of PTDLBCL（n=81），primary non-tonsillar diffuse large B cell lymphoma（PNTDLBCL）（n=42），nasal NK/T cell lymphoma（NK/T）（n=10）and tonsillar chronic inflammatory conditions（n=20）were detected with EBV encoded miRNA （EBERs）in situhybridization（ISH）（n=123）and latent membrane protein 1（LMP1）gene PCR（n=31）.The difference of EBV detection between them were analyzed.ResultsEBERs ISH result showed that the detection rate of EBV in PTDLBCL was statistically higher than that in PNTDLBCL （t=5.603，P=0.018）.The detection rate of EBV using LPM1 PCR was statistically higher than using EBERs ISH （t=11.139，P=0.001）in PTDLBCL.EBVwas statistically significant positive correlation with patient＇s prognosis（t=5.683，P=0.017）；EBV was not significantly related with age，primary location and gender of patients with PTDLBCL.ConclusionsThe higher detection rate of EBV in PTDLBCL is positively related with patients＇prognosis.In the detection of EBV in PTDLBCL，LMP1 PCR was more sensitivity than EBERs ISH，while EBERs ISH was more specificity than LMP1 PCR.