莫翠菊秦 雪康曉楠彭契六江 凱2，盧 宇隋靖喆翟勵敏劉銀坤2，李 山△

（1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 南寧 530021；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所 上海 200032；3復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032）

肝細胞生長因子（HGF）誘導(dǎo)肝癌Huh7細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）后細胞膜表面糖蛋白糖譜的變化

莫翠菊1，2▲秦 雪1▲康曉楠3彭契六1江 凱2，3盧 宇1隋靖喆1翟勵敏1劉銀坤2，3李 山1△

（1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 南寧 530021；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所 上海 200032；3復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032）

目的應(yīng)用凝集素芯片技術(shù)尋找肝癌細胞表面轉(zhuǎn)移相關(guān)的特征性糖譜。方法應(yīng)用肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）誘導(dǎo)建立肝癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）細胞模型。通過凝集素芯片比較誘導(dǎo)前后細胞膜的糖譜改變，采用凝集素印跡和熒光細胞凝集素免疫組化方法驗證芯片結(jié)果。結(jié)果誘導(dǎo)后細胞對凝集素ACL、BPL、JAC、MPL、PHA-E、SBA和SNA的親和作用減弱，而對凝集素 AAL、Con A、DBA、GSL Ⅱ、ECL、HAL、LCA、LTL、NML、NPL、PHA-L、PTL Ⅱ和 WFL的親和作用增強。提示誘導(dǎo)后肝癌細胞表面出現(xiàn)了黏蛋白T/Tn抗原、平分型N-乙酰葡萄糖胺、α2，6唾液酸和末端α或β連接的N-乙酰半乳糖胺結(jié)構(gòu)減少；而末端和核心巖藻糖、高甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺β1，6分支和復(fù)雜型寡糖分支結(jié)構(gòu)增多。結(jié)論肝癌細胞發(fā)生EMT過程中細胞膜表面糖鏈結(jié)構(gòu)改變，提示糖鏈結(jié)構(gòu)與肝癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為有效控制肝癌轉(zhuǎn)移、改善預(yù)后提供了新思路。

凝集素芯片； 糖譜； 肝癌（HCC）； 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）； 肝細胞生長因子（HGF）

蛋白質(zhì)糖基化是翻譯時一種重要的共修飾方式，蛋白質(zhì)糖基化修飾伴隨多種腫瘤的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移，并會隨著病情而改變[1]。細胞表面糖基化與細胞識別、黏附、受體活化、癌變等過程緊密相關(guān)，因此尋找特征性改變的糖鏈結(jié)構(gòu)對于腫瘤的早期診斷、病程監(jiān)測和預(yù)后評估具有重要作用。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的高死亡率腫瘤，轉(zhuǎn)移是肝癌得到有效治療的主要障礙。肝細胞癌是一種上皮源性腫瘤，目前腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能被機制是腫瘤研究的熱點。

許多研究已證明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是上皮源性腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[2]。EMT是指在一定條件下上皮細胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變，即失去細胞極性和緊密連接并獲得了侵襲和遷移能力，同時上皮細胞和間質(zhì)細胞標志物表達發(fā)生改變。經(jīng)細胞、動物模型和臨床試驗證明，EMT與肝癌侵襲、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及低存活率密切相關(guān)[3]。研究表明蛋白質(zhì)糖基化在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，如甲胎蛋白核心巖藻糖基化（AFP-L3）是肝癌的特異性標志物，可用于肝癌的早期診斷和預(yù)后判斷[4]。因此，尋找肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異性糖基化糖鏈結(jié)構(gòu)將為有效控制肝癌轉(zhuǎn)移、改善預(yù)后提供新思路。

本研究通過體外培養(yǎng)上皮性肝癌Huh7細胞株，用肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生EMT。利用凝集素芯片比較誘導(dǎo)前后肝癌細胞膜表面糖鏈結(jié)構(gòu)變化，根據(jù)凝集素與糖鏈親和的特異性判斷細胞膜上的糖鏈類型，以尋找肝癌細胞表面轉(zhuǎn)移相關(guān)的特征性糖譜。

材料和方法

材料肝癌細胞株Huh7（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院）；高糖DMEM培養(yǎng)基（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；PCR引物（上海生工生物技術(shù)有限公司）；Taq DNA聚合酶（日本Ta KaRa公司）；PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；細胞裂解液和BCA法蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；ProteoExtractTM天然膜蛋白提取試劑盒（德國Merk公司）；MemcodeTM染膜試劑盒（美國Pierce公司）；HGF（R&D公司）；E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白抗體（美國BD公司），Snail抗體（英國Abcam公司），GAPDH抗體（上?？党缮锕こ逃邢薰荆?；凝集素（美國Vector公司）；Cy5染料（美國GE公司）；凝膠基質(zhì)素芯片、芯片點樣儀Smart Arrayer-48和熒光掃描儀LuxScan 3.0（北京博奧生物有限公司）。

細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)Huh7細胞。以1×105/孔接種于六孔板，24 h后將含血清DMEM換成無血清DMEM，加入10 ng/m L HGF誘導(dǎo)72 h，并以無血清DMEM培養(yǎng)細胞作為對照。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

熒光定量PCR反應(yīng)用Trizol試劑提取誘導(dǎo)前后細胞總RNA，以2 mg RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA，然后以cDNA為模板進行定量PCR，qRTPCR反應(yīng)體系：10μL SYBR Green PCR Master Mix，上下游引物各0.5μL，cDNA 1μL，補水至總體積20μL。擴增程序為：95℃，5 min；95℃，15 s，60℃，15 s，72℃，20 s；共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，各引物序列見表1。

Western hlot檢測提取誘導(dǎo)前后細胞總蛋白，與5×加樣緩沖液混勻，煮沸5 min。取20μg蛋白，用10%SDS-PAGE分離電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入E-鈣黏蛋白（1∶1 000）、N-鈣黏蛋白（1∶2 000）、Snail（1∶1 000）及GAPDH （1∶10 000）抗體稀釋液，4℃搖動孵育過夜。0.1%TBST洗膜3次，再加入HRP標記的二抗（1∶10 000），室溫反應(yīng)1 h；0.1%TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光檢測蛋白條帶。

表1 熒光定量PCR反應(yīng)各引物序列Tah 1 Primers of qRT-PCR

細胞侵襲實驗將誘導(dǎo)前后的細胞用無血清的DMEM制成細胞懸液；取5×104個細胞種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室中，下室加入600 μL條件培養(yǎng)基（300μL已培養(yǎng)相應(yīng)細胞的培養(yǎng)上清+300μL含10%胎牛血清的DMEM），置于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h。取出Transwell小室，吸棄小室內(nèi)液體，用棉簽擦凈上室細胞，PBS漂洗后甲醇固定30 min；Giemsa染色30 min，PBS漂洗10 min，倒置顯微鏡下觀察、計數(shù)并拍照。

細胞凝集素芯片技術(shù)及統(tǒng)計學(xué)處理用胰酶消化誘導(dǎo)前后細胞，4℃下125×g離心5 min，PBS清洗2次。細胞用3%戊二醛室溫固定15 min，加入0.1 mol/L Na2CO3·Na HCO3標記的緩沖液（p H 9.3）300μL。用Na HCO3標記的緩沖液溶解Cy5染料，加液至100μL。將50μL染料加入300μL細胞懸液中混勻，37℃避光孵育1 h標記細胞膜表面糖蛋白，每10～20 min攪拌1次，避免細胞成團。4℃下125×g離心5 min，PBS漂洗2次，重懸細胞濃度調(diào)整為1×106/m L。

芯片每孔加入2%BSA-TBS 100μL，室溫孵育1 h，用0.1%PBST洗3次，水平離心機1 000×g離心3 min，甩干液體。將標記好的細胞懸液加到芯片上，每孔100μL，37℃孵育3 h，水平均勻搖晃，以利于標記的膜蛋白和芯片上的凝集素結(jié)合。孵育后用0.1%PBST洗去未結(jié)合的細胞，水平離心機1 000×g離心3 min甩干液體。最后用熒光掃描儀LuxScan 3.0掃描細胞膜糖蛋白和凝集素的結(jié)合信號，將每個點的熒光信號讀數(shù)減去背景熒光讀數(shù)所得的值納入后續(xù)統(tǒng)計分析。中位值矯正法矯正不同芯片熒光讀數(shù)的熒光偏差，矯正后的值每6個重復(fù)點計算xˉ±s，用SPSS 16.0軟件進行t檢驗分析，倍數(shù)改變≥1.5和P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

凝集素印跡依照天然膜蛋白提取試劑盒說明書提取誘導(dǎo)前后的細胞膜蛋白。30μg膜蛋白用10%SDS-PAGE分離電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，按照MemCode可逆蛋白染色試劑盒說明書對膜進行染色，對比兩組樣本上樣量是否一致，同時作為內(nèi)參。膜脫色后用3%BSA+0.1%TBST室溫封閉1 h，然后加入生物素標記的凝集素室溫孵育30 min；0.1%TBST洗膜后，加入抗生素蛋白D-HRP，室溫孵育30 min；0.1%TBST洗膜，進行ECL化學(xué)發(fā)光檢測，用Quantity One軟件進行掃描結(jié)果分析。

熒光細胞凝集素免疫組化將對照組細胞和HGF誘導(dǎo)72 h的細胞接種于24孔板培養(yǎng)，篩選60%～80%融合的細胞進行實驗。PBS漂洗后，甲醇固定15 min，PBS漂洗3次。每孔分別加入生物素標記的凝集素，室溫搖30 min，PBS漂洗3次。加入Streptavidin-Alexa fluor 488（1∶1 000），室溫振搖30 min，PBS漂洗3次。細胞核用DAPI染色（1∶2 000），室溫孵育5 min，PBS漂洗3次。24孔板置于熒光倒置顯微鏡下觀察，相同的顯微鏡設(shè)置條件均拍攝細胞圖像。

結(jié) 果

HGF誘導(dǎo)前后Huh7細胞的形態(tài)學(xué)變化與誘導(dǎo)前比較，經(jīng)HGF誘導(dǎo)72 h后，上皮來源的Huh7細胞由多邊形向成纖維樣細胞形態(tài)改變（圖1）。

圖1 HGF誘導(dǎo)前后Huh7細胞的形態(tài)變化（200×）Fig 1 Morphological changes of Huh7 cells hefore and after HGF treatment（200×）

HGF誘導(dǎo)前后Huh7細胞EMT相關(guān)標志物的表達變化E-鈣黏蛋白是典型的上皮細胞標志物，而N-鈣黏蛋白、Snail則是間質(zhì)細胞標志物，熒光定量PCR和 Western blot結(jié)果顯示（圖2），經(jīng) HGF誘導(dǎo)72 h后E-鈣黏蛋白mRNA和蛋白質(zhì)表達水平較對照組明顯減少，而N-鈣黏蛋白和Snail的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

HGF誘導(dǎo)前后Huh7細胞侵襲能力的改變Transwell小室侵襲實驗檢測HGF誘導(dǎo)后細胞的侵襲能力改變，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后穿過膠質(zhì)膜的細胞數(shù)明顯增加（P=0.03，圖3），說明HGF處理后細胞的侵襲能力增強。

圖2 HGF誘導(dǎo)前后Huh7細胞EMT相關(guān)基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達變化Fig 2 The expressions of mRNA and protein in Huh7 cells hefore and after HGF treatmentA：qRT-PCR analysis；B：Western blot analysis.vs.Control，（1）P＜0.05.

圖3 HGF誘導(dǎo)前后Huh7細胞侵襲實驗的結(jié)果（200×）Fig 3 Matrigel cell invasion assay of Huh7 cells hefore and after HGF treatment（200×）

HGF誘導(dǎo)Huh7發(fā)生EMT后細胞膜糖蛋白糖譜變化采用本實驗室點制有50種腫瘤相關(guān)凝集素的芯片，比較誘導(dǎo)前后細胞膜糖蛋白糖譜，重復(fù)實驗3次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后細胞對凝集素ACL、BPL、JAC、MPL、PHA-E、SBA和SNA的親和作用減弱，而對凝集素 AAL、Con A、DBA、GSL Ⅱ、ECL、HAL、LCA、LTL、NML、NPL、PHA-L、PTLⅡ和WFL的親和作用增強（圖4）。提示誘導(dǎo)后肝癌細胞表面出現(xiàn)了黏蛋白T/Tn抗原（T/Tnantigen）、平分型 N-乙酰葡萄糖胺 （bisecting Glc NAc）、α2，6唾液酸和末端α或β連接的N-乙酰半乳糖胺（N-GlaNAc）結(jié)構(gòu)減少；而末端和核心巖藻糖（terminal or core fucose）、高甘露糖（high mannose）、α或β連接N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺β1，6分支（β1，6 Glc NAc branching）和復(fù)雜型寡糖分支結(jié)構(gòu)增多。

選取生物素標記的凝集素PHA-E、SNA、AAL、LCA和PHA-L，通過凝集素印跡方法和熒光細胞凝集素免疫組化驗證芯片結(jié)果（圖5、6），驗證結(jié)果與芯片結(jié)果一致，說明芯片結(jié)果是可靠的。

圖4 HGF誘導(dǎo)前后Huh7細胞膜糖蛋白糖譜變化Fig 4 The alteration of cell surface glycan profiling in Huh7 cells hefore and after HGF treatmentA：Lectin microarray system；B：Reduced cell surface glycan pattern in EMT；C：Raised cell surface glycan pattern in EMT.Data were showed ass of 3 independent assay.vs.control，（1）P＜0.05，（2）P＜0.01.

圖5 HGF誘導(dǎo)前后Huh7細胞與凝集素相結(jié)合的凝集素印跡圖Fig 5 The affinity of Huh7 cells and lectin hlot hefore and after HGF inductionM：Marker；C：Control.

圖6 HGF誘導(dǎo)前后Huh7細胞與凝集素相結(jié)合的熒光細胞凝集素免疫組化圖（100×）Fig 6 The affinity of Huh7 cells and lectin hefore and after HGF treatment analyzed hy fluorescence cell lectin-immunochemistry（100×）

討 論

EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，EMT的發(fā)生可受環(huán)境刺激或胞外基質(zhì)因子調(diào)節(jié)。HGF是肝細胞分泌的種多功能細胞因子，在一些腫瘤模型中，HGF可誘導(dǎo)EMT出現(xiàn)，降低腫瘤細胞間的黏附并增強侵襲力。在本實驗中，我們通過HGF誘導(dǎo)成功建立了肝癌Huh7細胞EMT模型。誘導(dǎo)后細胞的形態(tài)呈現(xiàn)紡錘樣變化，侵襲能力比誘導(dǎo)前明顯增強，且EMT相關(guān)指標E-鈣黏蛋白表達減低，而N-鈣黏蛋白和轉(zhuǎn)錄因子Snail表達增高。E-鈣黏蛋白表達下調(diào)可以啟動細胞的EMT[5]，而N-鈣黏蛋白的表達增加也與EMT呈正比[6]，E-鈣黏蛋白向N-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)化可以指示腫瘤細胞的EMT進程。Snail是多條信號通路共同的下游靶點，在EMT調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。本研究的基因和蛋白質(zhì)結(jié)果與以往研究一致，提示HGF可以誘導(dǎo)肝癌細胞的EMT轉(zhuǎn)化。

異常改變的細胞膜糖鏈在腫瘤細胞免疫逃避和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，如細胞膜唾液酸化和β1，6支鏈N-聚糖可促進腫瘤細胞的分化增殖、轉(zhuǎn)移[7-8]。親和色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、核磁共振等糖分析技術(shù)均不適合全面分析糖譜變化，也不能進行高通量分析。凝集素芯片技術(shù)是一種新出現(xiàn)的快速糖分析技術(shù)，具有高通量性和高敏感性。本實驗中，我們用凝集素芯片檢測完整的細胞膜表面糖譜，直接將Cy5標記的細胞與芯片雜交，洗去未結(jié)合細胞后，將結(jié)合在凝集素芯片上的細胞直接用于熒光掃描。我們所用的是一種凝膠基質(zhì)凝集素芯片，曾用來鑒別標準糖蛋白去唾液酸胎球蛋白（asialofetuin，ASF）和胎球蛋白（fetuin，F(xiàn)ET）的糖鏈差異，得出了準確結(jié)果，還成功用于區(qū)分不同來源的AFPN-糖譜[9]。這些前期工作保證了這種凝集素芯片系統(tǒng)檢測結(jié)果的準確性。

糖鏈結(jié)構(gòu)改變與腫瘤的進展密切相關(guān)。Guan等[10]和Freier-de-Lima等[11]在TGF-β誘導(dǎo)EMT進程中發(fā)現(xiàn)糖苷神經(jīng)鞘脂類下調(diào)而胚胎纖連蛋白O-糖基化程度增加[10-11]。Chammas等[12]利用基因芯片發(fā)現(xiàn)了40種與EMT相關(guān)的糖基因，如GALNT2、GALNT10等糖基轉(zhuǎn)移酶基因在細胞EMT過程中表達上調(diào)。目前對腫瘤細胞侵襲過程中糖譜表達變化的研究較少見。在本研究中，我們采用凝集素芯片篩選出20種參與肝癌EMT細胞膜糖蛋白親和強度改變的凝集素。發(fā)生EMT的細胞組對PHA-L的親和作用強于PHA-E，這兩種凝集素分別識別β1，6分支和平分型N-GlcNAc結(jié)構(gòu)，而這兩種結(jié)構(gòu)分別由N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V（Gn T-V）和N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ（Gn T-Ⅲ）催化生成，Gn T-Ⅲ催化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）中的GlcNAc轉(zhuǎn)移至N-聚糖核心的β-Man上，生成β1，4-Glc NAc，也稱為平分型N-GlcNAc。據(jù)文獻報道，Gn T-Ⅲ是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其過表達抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機制為：增加細胞-細胞間的黏附及下調(diào)細胞-細胞外基質(zhì)間的粘附。Gn T-Ⅲ催化合成的平分型結(jié)構(gòu)抑制α3β1和α5β1整合蛋白與細胞外基質(zhì)層黏連蛋白（laminins）結(jié)合而參與細胞遷移[13]。Deb等[14]證明Gn T-Ⅲ介導(dǎo)E-鈣黏蛋白N-糖基化可促進TGF-β1誘發(fā)EMT，而抑制Gn T-Ⅲ可以使EMT改變恢復(fù)到MET狀態(tài)。Xu等[15]發(fā)現(xiàn)過表達Gn T-Ⅲ可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)EMT和β-catenin的核定位及細胞遷移；而下調(diào)Gn T-Ⅲ表達和上調(diào)Gn T-V表達可增強TGF-β1誘導(dǎo)EMT。Gn T-V催化UDP-GlcNAc中的GlcNAc轉(zhuǎn)移到N-糖鏈核心α1，6臂的α-Man上，形成N-糖鏈的β-1，6分支結(jié)構(gòu)。與Gn T-Ⅲ抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相反，Gn T-Ⅴ與細胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Gn T-V催化增加的β-1，6分支通過降低整合蛋白介導(dǎo)的黏附和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，減少細胞黏附，增加腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[13]。在Gn T-V轉(zhuǎn)基因鼠中發(fā)現(xiàn)，Gn T-V通過增強EGF受體信號來促進EMT和角質(zhì)細胞侵襲[16]。在本研究中我們用凝集素芯片成功捕捉到這一經(jīng)典轉(zhuǎn)移相關(guān)的糖鏈改變。同樣，我們采用凝集素印跡和熒光細胞免疫化學(xué)方法在細胞膜蛋白和細胞表面檢測到了這一糖鏈結(jié)構(gòu)變化，驗證了芯片結(jié)果的準確性。

核心巖藻糖，即α1，6巖藻糖，是肝癌轉(zhuǎn)移的一種重要糖基化修飾。甲胎蛋白巖藻糖基化，即AFPL3是肝癌診斷的特異指標，預(yù)示更高的轉(zhuǎn)移可能性[3]。核心巖藻糖由α1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α1，6 Fuc T）催化形成，α1，6 Fuc T與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)特異親和巖藻糖結(jié)構(gòu)的凝集素AAL和LCA在EMT模型中信號增強。Dai等[17]發(fā)現(xiàn)組織和細胞內(nèi)蛋白的核心巖藻糖基化程度隨肝癌轉(zhuǎn)移潛能的增加而增加。T/Tn抗原是腫瘤細胞表面黏蛋白相關(guān)的一種糖抗原標志物，可被凝集素ACL、BPL、JAC和MPL所識別。T/Tn抗原常在結(jié)腸癌和乳腺癌中表達增高，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移預(yù)后相關(guān)[18-19]。我們發(fā)現(xiàn)在肝癌EMT中T/Tn抗原表達減少，這為肝癌轉(zhuǎn)移研究提供了參考數(shù)據(jù)。通過凝集素芯片技術(shù)我們還發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)發(fā)生EMT后肝癌細胞表面的高甘露糖結(jié)構(gòu)增多，而α2，6唾液酸結(jié)構(gòu)減少，有研究報道甘露糖結(jié)構(gòu)增加可能與腫瘤惡性表型相關(guān)，在人和鼠肝癌中均可見甘露糖結(jié)構(gòu)修飾增多的GGT[20]。我們的研究結(jié)果與孫海艷等[21]的報道一致，即α2，6唾液酸結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)移性肝癌中表達下調(diào)，但也有研究顯示唾液酸結(jié)構(gòu)增加可減少腫瘤細胞對胞外基質(zhì)的黏附[7]。細胞EMT轉(zhuǎn)化的機制十分復(fù)雜，可能有多種因素參與，因此鑒定與這些結(jié)構(gòu)改變相關(guān)的糖蛋白并闡明其在EMT進程中的作用機制是未來研究的重點。

用凝集素芯片捕獲細胞膜表面糖鏈結(jié)構(gòu)表達譜變化存在一定的局限性，如凝集素結(jié)合糖鏈結(jié)構(gòu)并非專一性，因此只能推測細胞膜糖鏈結(jié)構(gòu)類型；凝集素與糖鏈的親和力小，在洗去未結(jié)合細胞時，可能同時洗掉一些表面糖鏈表達低的細胞，致其無法被檢測出來。但鑒于凝集素芯片技術(shù)的快速和高通量性，可對細胞膜表面糖鏈結(jié)構(gòu)變化進行動態(tài)、通量的檢測。我們利用這一技術(shù)捕獲了肝癌細胞EMT過程中細胞膜糖蛋白糖譜變化，而與之對應(yīng)的糖蛋白或糖基轉(zhuǎn)移酶基因可能成為阻止發(fā)生EMT的干預(yù)靶點，從而為防治肝癌轉(zhuǎn)移和改善預(yù)后提供新的依據(jù)。

[1] Apweiler R，Hermjakob H，Sharon N.On the frequency of protein glycosylation，as deduced from analysis of the SWISS-PRo T database[J].Biochim Biophys Acta，1999，1473（1）：4-8.

[2] Turley EA，Veiseh M，Radisky DC，et al.Mechanisms of disease：epithelial-mesenchymal transition-does cellular plasticity fuel neoplastic progression？[J].Nat Clin Pract Oncol，2008，5（5）：280-290.

[3] Yang MH，Chen CL，Chau GY，et al.Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，2009，50（5）：1464-1474.

[4] Meany DL，Chan DW.Aberrant glycosylation associated with enzymes as cancer biomarkers[J].Clin Proteomics，2011，8（1）：7.

[5] Liu YN，Liu Y，Lee HJ，et al.Activated androgen receptor downregulates E-cadherin gene expression and promotes tumor metastasis[J].Mol Cell Biol，2008，28（23）：7096-7108.

[6] Yoon WH，Song IS，Lee BH，et al.Differential regulation of vimentin mRNA by 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate and all-trans-retinoic acid correlates with motility of Hep 3B human hepatocellular carcinoma cells[J].Cancer Lett，2004，203（1）：99-105.

[7] Dennis J，Waller C，Timpl R，et al.Surface sialic acid reduces attachment of metastatic tumour cells to collagen type IV and fibronectin[J].Nature，1982，300（5889）：274-276.

[8] Dennis JW，Laferté S，Waghorne C，et al.Beta 1-6 branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis[J].Science，1987，236（4801）：582-585.

[9] Chen P，Liu Y，Kang X，et al.Identification of N-glycan of alpha-fetoprotein by lectin affinity microarray[J].J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（8）：851-860.

[10] Guan F， Handa K， Hakomori SI.Specific glycosphingolipids mediate epithelial-to-mesenchymal transition of human and mouse epithelial cell lines[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（18）：7461-7466.

[11] Freire-de-Lima L，Gelfenbeyn K，Ding Y，et al.Involvement of O-glycosylation defining oncofetal fibronectin in epithelial-mesenchymal transition process[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（43）：17690-17695.

[12] Chammas R，Maupin KA，Sinha A，et al.Glycogene expression alterations associated with pancreatic cancer epithelial-mesenchymal transition in complementary model systems[J].PLoS ONE，2010，5（9）：e13002.

[13] Pinho SS，Seruca R，G?rtner F，et al.Modulation of E-cadherin function and dysfunction by N-glycosylation[J].Cell Mol Life Sci，2011，68（6）：1011-1020.

[14] Deb S，Pinho SS，Oliveira P，et al.Loss and recovery of Mgat3 and Gn T-Ⅲmediated E-cadherin N-glycosylation is a mechanism involved in epithelial-mesenchymalepithelial transitions[J].PLoSONE，2012，7（3）：e33191.

[15] Xu Q，Isaji T，Lu Y，et al.Roles of NAcetylglucosaminyltransferaseⅢin epithelial-tomesenchymal transition induced by transforming growth factorβ1 （TGF-β1）in epithelial cell lines[J].J Biol Chem，2012，287（20）：16563-16574.

[16] Terao M，Ishikawa A，Nakahara S，et al.enhanced epithelial-mesenchymal transition-like phenotype in NAcetylglucosaminyltransferase V transgenic mouse skin promotes wound healing[J].J Biol Chem，2011，286（32）：28303-28311.

[17] Dai Z，Liu YK，Cui JF，et al.Identification and analysis of alteredα1，6-fucosylated glycoproteins associated with hepatocellular carcinoma metastasis[J].Proteomics，2006，6（21）：5857-5867.

[18] Itzkowitz SH，Yuan M，Montgomery CK，et al.Expression of Tn，sialosyl-Tn，and T antigens in human colon cancer[J].Cancer Res，1989，49（1）：197-204.

[19] Konska G，Guerry M，Caldefie-Chezet F，et al.Study of the expression of Tn antigen in different types of human breast cancer cells using VVA-B4 lectin.[J].Oncol Rep，2006，15（2）：305-310.

[20] Furmanski P，Phillips PG，Lubin M.Cell surface interactions with concanavalin A：determination by microhemadsorption[J].Proc Soc Exp Biol Med，1972，140（1）：21621-9.

[21] 孫海艷，李巖，郭坤，等.肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨橋蛋白表達及其糖基化的改變[J].中華肝臟病雜，2011，19（12）：904-907.

Changes of glycan profiling in cell surface after hepatocyte growth factor（HGF）induced epithelial mesenchymal transition（EMT）in Huh7 hepatocellular carcinoma cells

MO Cui-ju1，2▲，QIN Xue1▲，KANG Xiao-nan3，PENG Qi-liu1，JIANG Kai2，3，LU Yu1，SUI Jing-zhe1，ZHAI Li-min1，LIU Yin-kun2，3，LI Shan1△
（1Department of Clinical Laboratory，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning530021，Guangxi Zhuang Autonomous Region，China；2Liver Cancer Institute，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai200032，China；3Institute of Biomedical Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai200032，China）

lectin microarray； glycan profiling； hepatocellular carcinoma（HCC）； epithelial mesenchymal transitions（EMT）； hepatocyte growth factor（HGF）

R 392.12

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.02.010

2013-05-13；編輯：段佳）

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目（973計劃）（2011CB 910604，2013CB 910501）；國家自然科學(xué)基金（81060199）；廣西自然科學(xué)基金（2012GXNSFAA053088）

▲Co-first authors

△Corresponding author E-mail：lis8858@163.com

【Ahstract】 OhJectiveTo search the specific cell surface glycan profiling related with hepatocellular carcinoma（HCC）metastasis by lectin microarray.MethodsHepatocyte growth factor（HGF）induced epithelial mesenchymal transition（EMT）model in Huh7 cells was established.Cell surface glycan profiling of Huh7 cells treated with or without HGF were compared by lectin microarray，thenthe results from lectin microarray were verified by lectin blot and fluorescence cell lectinimmunochemistry.ResultsThe binding affinities to 7 lectins ACL，BPL，JAC，MPL，PHA-E，SBA and SNA were reduced in HGF induced EMT cells，meanwhile the affinities to bind 13 lectins，AAL，Con A，DBA，GSLⅡ，ECL，HAL，LCA，LTL，NML，NPL，PHA-L，PTL Ⅱand WFL，were increased with statistic significance.It implied that the decreased T/Tn-antigen，NA2 and bisecting Glc NAc，Siaα 2-6 Gal/Gal NAc，terminalαorβGal NAc structures，and the increased terminal and core fucose，high mannose，β1，6 Glc NAc branching and tetraantennary complex oligosaccharides structures may be involved in the changed glycan profiles as EMT process happened in Huh7 cells.ConclusionsCell surface glycan altered in the EMT process and it may be closely related to the metastasis of HCC.This finding provides a new idea for HCC metastasis and prognosis.

*This work was supported hy the National Research Program of China（973 Program）（2011CB 910604，2013CB 910501）；the National Natural Science Foundation of China （81060199）and the National Natural Science Foundation of Guangxi，China（2012GXNSFAA053088）.