孫偉，李堅(jiān)，陳園園

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

上皮細(xì)胞黏附分子和黏蛋白mRNA檢測在良性和惡性胸腔積液鑒別診斷中的臨床價(jià)值

孫偉1，李堅(jiān)1，陳園園2

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：評價(jià)上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial celladhesionmolecule，EpCAM）mRNA和黏蛋白1（mucin 1）mRNA表達(dá)水平在良性和惡性胸腔積液鑒別診斷中的臨床價(jià)值。方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測51例原發(fā)于非小細(xì)胞肺癌的惡性胸腔積液患者和22例結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液標(biāo)本中的EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA的表達(dá)水平。構(gòu)建受試者工作特征（ROC）曲線圖。計(jì)算這兩個(gè)腫瘤標(biāo)志物獨(dú)立或聯(lián)合測定診斷惡性胸腔積液的敏感性和特異性。結(jié)果：惡性胸腔積液患者胸腔積液標(biāo)本中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA的表達(dá)水平均明顯高于結(jié)核性胸膜炎患者（P＝0.000）。根據(jù)ROC曲線取EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA水平的上限值，分別為14.64和11.82；結(jié)果顯示，EpCAM mRNA診斷惡性胸腔積液的敏感性和特異性分別為84.3%和90.9%，黏蛋白1 mRNA診斷惡性胸腔積液的敏感性和特異性分別為86.3%和86.4%。采用串行試驗(yàn)聯(lián)合評價(jià)EpCAM mRNA與黏蛋白1 mRNA測定診斷惡性胸腔積液的敏感度和特異性分別為80.4%和95.5%；以平行試驗(yàn)聯(lián)合評價(jià)EpCAM mRNA與黏蛋白1 mRNA測定的敏感性和特異性分別為90.2%和81.8%。結(jié)論：EpCAM mRNA與黏蛋白1 mRNA對良性和惡性胸腔積液的鑒別診斷具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，聯(lián)合檢測胸腔積液中EpCAM mRNA與黏蛋白1 mRNA可進(jìn)一步提高對惡性胸腔積液的診斷效率。

上皮細(xì)胞黏附分子；黏蛋白1；惡性胸腔積液；結(jié)核性胸膜炎；診斷

胸腔積液是由多種疾病導(dǎo)致胸膜腔液體滲出增多或者回吸收減少引起的常見臨床綜合征。不同疾病導(dǎo)致的胸腔積液治療方法和預(yù)后截然不同，故病因的診斷，尤其是良性和惡性胸腔積液的鑒別診斷極為重要。惡性胸腔積液的診斷確定主要依靠胸腔積液細(xì)胞學(xué)檢查和胸膜活檢的病理組織學(xué)檢查；其中，胸腔積液脫落細(xì)胞檢查是診斷惡性胸腔積液的金標(biāo)準(zhǔn)，陽性率為50%～60%［1］，但敏感性較低，容易漏診，診斷結(jié)果不確定。因此，對很多具有潛在診斷價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物的研究增多，但得到的結(jié)果差異較大［2－5］，其原因有多方面，如腫瘤組織學(xué)類型不同致細(xì)胞學(xué)判斷的難易程度存在差異、不同研究者使用的實(shí)驗(yàn)室檢測方法不同、胸腔積液標(biāo)本中腫瘤標(biāo)志物定義折點(diǎn)方法不同等［6］。與其他腫瘤標(biāo)志物相比，癌胚抗原診斷惡性胸腔積液具有較高的準(zhǔn)確性［1，7］，但在良惡性胸腔積液鑒別診斷中仍有不同程度假陽性結(jié)果，降低了臨床應(yīng)用價(jià)值［3－4］。

CA19-9是診斷消化道惡性腫瘤的標(biāo)志物，主要用于胰腺和膽道系統(tǒng)的惡性腫瘤的診斷。廖君群［8］研究表明，CA19-9在惡性胸腔積液組中表達(dá)水平明顯高于良性積液組，對鑒別診斷有一定的參考價(jià)值，但敏感性較低，僅44.9%，對臨床上高度疑似惡性胸腔積液者漏診概率增大。因此，探尋新的具有高敏感性和特異性的腫瘤標(biāo)志物來診斷惡性胸腔積液很有必要。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測51例原發(fā)于非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的胸腔積液患者和22例結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液標(biāo)本中上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）mRNA和黏蛋白1（mucin 1）mRNA的表達(dá)水平，評價(jià)其在惡性胸腔積液診斷中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 病例

選擇2012年10月至2013年10月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院住院的由NSCLC引起的惡性胸腔積液患者51例，其中男30例，女21例，年齡47～84歲，平均65歲。所有患者的原發(fā)腫瘤均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診，胸腔積液的惡性性質(zhì)由脫落細(xì)胞學(xué)檢查或胸膜活檢病理組織學(xué)檢查確定。NSCLC的組織學(xué)類型包括鱗癌35例，腺癌16例。

另選擇同期住院的22例結(jié)核性胸膜炎患者作為良性胸腔積液對照組，其中，男12例，女10例，年齡50～78歲，平均62歲。所有結(jié)核性胸膜炎患者均符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn)中任何一項(xiàng)：痰或胸腔積液抗酸桿菌陽性；胸膜活檢有結(jié)核的病理組織學(xué)證據(jù)；胸腔積液腺苷脫氨酶＞28 U／L，臨床抗結(jié)核治療有效。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，同時(shí)選取14名健康受試者的血標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)mRNA對照（樣本mRNA校對值），其中，男7例，女7例，年齡55～70歲，平均60歲。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 人淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝揚(yáng)生物制品科技有限責(zé)任公司，反轉(zhuǎn)錄試劑購自美國Fermentas公司，熒光定量PCR試劑購自日本Toyobo公司，CFX96型熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2.2 標(biāo)本處理 所有入組人員均抽取胸腔積液200 mL，EDTA抗凝，1 h內(nèi)分離淋巴細(xì)胞。細(xì)胞總RNA的提取嚴(yán)格按照Trizol試劑操作步驟進(jìn)行，應(yīng)用分光光度計(jì)測定RNA的D（260 nm）／D（280 nm）值。嚴(yán)格按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 引物序列全長選自Pubmed基因庫，引物序列由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成，經(jīng)基因庫核實(shí)。EpCAM、黏蛋白1及內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白的引物和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng) 每份胸腔積液標(biāo)本均擴(kuò)增β-肌動(dòng)蛋白及EpCAM和黏蛋白1。每個(gè)反應(yīng)終體積20μL，其中，反轉(zhuǎn)錄混合物2μL，DEPC處理水7μL，上下游引物各0.5μL，PCR混合物10 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)后制作 熔解曲線。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.5 結(jié)果分析 測定EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA在胸腔積液中表達(dá)的Ct值，用2－△△Ct表示相對表達(dá)量，構(gòu)建受試者工作特征（ROC）曲線圖。根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果確定在診斷惡性胸腔積液時(shí)獲得最大敏感性和特異性的EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA閾值（上限值），分別為14.64和11.82，高于該閾值為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。mRNA的表達(dá)量呈非正態(tài)分布，故兩組間的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。兩組間陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA在良惡性胸腔積液中的表達(dá)

惡性胸腔積液組患者EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA的表達(dá)水平均明顯高于結(jié)核性胸膜炎患者（P＝0.000）。以14.64和11.82分別作為胸腔積液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA閾值時(shí)，惡性胸腔積液患者胸腔積液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA的陽性率分別為84.3%和86.3%，良性肺疾病患者陽性率分別為9.1%和13.6%。兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000），見表2。

表2 兩組患者胸腔積液中EpCAM m RNA和黏蛋白1 m RNA水平和陽性率的比較

2.2 ROC曲線對胸腔積液標(biāo)本EpCAM mRNA診斷效率的判斷

EpCAM mRNA ROC曲線下面積為0.874（標(biāo)準(zhǔn)誤為0.044），取14.64為其表達(dá)量上限時(shí)，敏感性為84.3%，特異性為90.9%。見圖1。

2.3 ROC曲線對胸腔積液標(biāo)本黏蛋白1 mRNA診斷效率的判斷

黏蛋白1 mRNA ROC曲線下面積為0.830（標(biāo)準(zhǔn)誤為0.060），取11.82為其表達(dá)量上限時(shí)，敏感性為86.3%，特異性為86.4%。見圖2。

2.4 兩個(gè)腫瘤標(biāo)志物對惡性胸腔積液的診斷價(jià)值

以ROC曲線確定的兩個(gè)腫瘤標(biāo)志物上限值為陽性時(shí)，EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA診斷惡性胸腔積液的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，見表3。當(dāng)聯(lián)合胸腔積液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA檢測結(jié)果分析時(shí)，如果以其中1項(xiàng)指標(biāo)陽性作為對惡性胸腔積液的診斷依據(jù) （平行試驗(yàn)），則敏感性為90.2%，特異性為81.8%；若以2項(xiàng)指標(biāo)均陽性作為對惡性胸腔積液的診斷依據(jù)（串行試驗(yàn)），敏感性為80.4%，但特異性上升至95.5%。

圖1 胸腔積液EpCAM m RNA的ROC曲線圖

圖2 胸腔積液黏蛋白1 m RNA的ROC曲線圖

3 討論

EpCAM又稱TACSTD1，屬于黏附分子家族，是由腫瘤相關(guān)基因編碼的一個(gè)跨膜蛋白，幾乎表達(dá)于所有的正常上皮中，且大都處于細(xì)胞間緊密連接處，但在鱗狀上皮中無表達(dá)。EpCAM在不同細(xì)胞中表達(dá)差別很大，在上皮來源的腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，而在結(jié)締組織及造血系統(tǒng)來源的細(xì)胞、腦組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞中則缺乏表達(dá)［9］。研究顯示，EpCAM過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞增殖活性高，侵襲性強(qiáng)，而其表達(dá)下調(diào)可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性及侵襲性［10］。Zhang等［11］根據(jù)RT-PCR對60例胸、腹腔滲出液脫落細(xì)胞EpCAM mRNA檢測后發(fā)現(xiàn)，其對惡性滲出液診斷的敏感性、準(zhǔn)確性分別為75.0%和81.6%，而細(xì)胞學(xué)檢查只有55.6%和67.3%。由此看出，EpCAM mRNA對良性和惡性滲出液鑒別有一定臨床價(jià)值，故EpCAM mRNA的檢測可作為細(xì)胞學(xué)檢查的輔助手段用于惡性滲出液的臨床診斷。

表3 EpCAM mRNA和黏蛋白1 m RNA對良惡性胸腔積液的鑒別診斷意義

黏蛋白是一種高分子量糖蛋白，在機(jī)體各種黏膜表面呈大量分布，迄今已發(fā)現(xiàn)有16種黏蛋白（MUC1～MUC16）。在黏蛋白家族中，黏蛋白1是一種Ⅰ型跨膜蛋白，占有重要地位。黏蛋白1造成肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制是抑制腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)間的黏附作用，致腫瘤細(xì)胞間黏附力減弱，進(jìn)而細(xì)胞脫離，發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移［12］。黏蛋白1對腫瘤細(xì)胞的黏附作用具有雙向調(diào)節(jié)功能，正常情況下，黏蛋白1主要在乳腺、胰腺、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多種組織、器官中的導(dǎo)管上皮細(xì)胞或腺腔面表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，黏蛋白1在腫瘤細(xì)胞表面呈高表達(dá)，表達(dá)量為正常細(xì)胞的10倍以上，且與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)［13］。國內(nèi)研究證明，NSCLC組織中黏蛋白1 mRNA的陽性表達(dá)率與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［14］。由于黏蛋白1具有腫瘤特異性表達(dá)的特點(diǎn)，最近有研究表明，胸腔積液中黏蛋白1 mRNA的表達(dá)在肺癌患者癌轉(zhuǎn)移的檢測中具有重要價(jià)值，可為臨床治療和預(yù)后評估提供重要的參考依據(jù)［15］。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者惡性胸腔積液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA表達(dá)水平明顯高于結(jié)核性胸膜炎患者。胸腔積液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA ROC曲線下面積結(jié)果說明，胸腔積液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA濃度越高，胸腔積液惡性的可能性越大。本研究中單個(gè)指標(biāo)比較結(jié)果顯示，胸腔積液中EpCAM mRNA的診斷效率優(yōu)于黏蛋白1 mRNA，雖然單獨(dú)檢測EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA對惡性胸腔積液的診斷有一定的價(jià)值，但尚有一定局限性；通過對EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA組合分析顯示，兩者聯(lián)合檢測不但敏感性提高，而且特異性還保持較高水平，表明兩者聯(lián)合檢測可互為補(bǔ)充，提高診斷的準(zhǔn)確性。

綜上所述，我們的研究初步表明，繼發(fā)于NSCLC患者惡性胸腔積液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA的表達(dá)水平明顯高于結(jié)核性胸膜炎患者，檢測胸腔積液中二者的表達(dá)水平對于良性和惡性胸腔積液的鑒別診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Diagnostic value of pleural fluid EpCAM m RNA and MUC1 m RNA in differentiating benign from malignant pleural effusion

SUNWei1，LI Jian1，CHEN Yuan-yuan2
（1.Department of Pulmonary Medicine，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Institute of Basal Medicine Science，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To evaluate the diagnostic value of epithelial cell adhesion molecule（EpCAM）mRNA and mucin 1（MUC1）mRNA expression levels in the pleural fluids for differentiating benign from malignant pleural effusion.M ethods：Quantitative real-time PCR was used to detect the expression levels of EpCAM mRNA and MUC1 mRNA in pleural effusion samples from 51 patientswith malignant pleural effusion caused by non-small cell lung cancer and 22 patients with tuberculous pleurisy.Receiver operative characteristic（ROC）curveswere constructed to assess diagnostic performance.The sensitivity，specificity and accuracy of individual or combined detections of EpCAM mRNA and MUC1 mRNA in the diagnosis of malignant pleural effusion were calculated.Results：The levels of pleural fluid EpCAM mRNA and MUC1 mRNA in patientswithmalignant pleural effusion were significantly higher than those in patientswith tuberculous pleurisy（P＝0.000）.According to the ROC curve analysis，cut-off values for EpCAM mRNA and MUC1 mRNA in pleural fluid from benign pleural effusion were 14.64 and 11.82，respectively.The sensitivity and specificity of EpCAM mRNA formalignant pleural effusion diagnosis were 84.3%and 90.9%，respectively.The detection of pleural fluid MUC1 mRNA achieved sensitivity of 86.3%and specificity of 86.4%，respectively.When combined EpCAM mRNA and MUC1 mRNA with a serial test，the sensitivityand specificitywere80.4%and 95.5%，respectively.Combination EpCAMmRNA and MUC1mRNA with a parallel test yielded the 90.2%sensitivity and 81.8%specificity，respectively.Conclusion：Pleural fluid EpCAM mRNA and MUC1mRNA were two useful tumormarkers in the diagnosis ofmalignant pleural effusion；combination of both two could improve diagnostic performance for distinguishing benign pleural effusion from malignant pleural effusion.

epithelial cell adhesionmolecule；mucin 1；malignant pleural effusion；uberculous pleurisy；diagnosis

R561.3

A

1671－7783（2014）04－0328－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140104

孫偉（1982—），男，碩士研究生；李堅(jiān)（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：lijian54126＠163.com

2014－04－17 ［編輯］劉星星