周晉，曹喜華，曹彤，陳紅兵

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院檢驗科，江蘇南京210008；2.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南南陽473058）

1株腸道病毒71型南京分離株的全基因組序列的測定及遺傳進化分析

周晉1，曹喜華2，曹彤1，陳紅兵1

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院檢驗科，江蘇南京210008；2.南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南南陽473058）

目的：對腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）南京分離株EV71-NJ2012全基因組核苷酸序列進行測定，并與基因庫中的代表性序列進行分析比對。方法：登錄基因庫，選取不同國家和地區(qū)的EV71全基因組序列，設(shè)計8對覆蓋病毒整個基因組且首尾部分重疊的引物，采用RT-PCR擴增出8個基因片段，通過測序和拼接獲得全基因組序列，并與國內(nèi)外其他EV71分離毒株一起用MEGA 4.0軟件進行進化樹分析，用DNAStar進行同源性分析。結(jié)果：EV71-NJ2012株的基因組長度為7 404 bp，其中5′非編碼區(qū)（UTR）長742 bp，3′UTR長82 bp，病毒基因組開放閱讀框（ORF）全長6 582 bp，編碼一個含有2 193個氨基酸殘基的多聚蛋白。病毒序列在分型上屬于C4a基因型，與上海株的核苷酸同源性最近，而與我國臺灣、湖北等分離株的核酸序列差異較大。結(jié)論：EV71-NJ2012株基因組的組成和結(jié)構(gòu)符合腸道病毒特征，與上海株親緣關(guān)系最近，而與我國臺灣、湖北分離株的差異較為明顯。EV71-NJ2012株可能與上海株來源于EV71病毒株的同一種系。

手足口病；腸道病毒71型；序列分析

手足口病是由人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，主要引起發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皰疹，以0.5～4歲的兒童多發(fā)，少數(shù)患兒可出現(xiàn)神經(jīng)源性肺水腫、心肌炎、腦膜炎和急性遲緩性麻痹等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響兒童的身體健康［1－3］。該病的流行已有60多年，自1957年新西蘭首次報道以來，先后在多個國家和地區(qū)暴發(fā)和流行。引起手足口病的病原有多種，以腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A16型（Cox A16）最為常見。相對而言，EV71能夠?qū)е赂鼮閲?yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，且其感染率在臨床上占據(jù)優(yōu)勢［4］。EV71為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約7 400 bp，包含幾個順式作用元件，其中包括5′和3′非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs），在病毒的復(fù)制和翻譯中起重要作用。UTRs間是基因組的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼2 193個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)蛋白前體P1和非結(jié)構(gòu)蛋白前體P2、P3［5］。P1可被加工為衣殼蛋白VP1～VP4，其中VP1區(qū)是基因分型的主要依據(jù)。

近年來EV71在國內(nèi)的流行呈上升趨勢，以C4基因型為主。這種情況與周邊國家和地區(qū)有所不同，例如在我國臺灣地區(qū)EV71病毒的流行有多個不同的型別。在江蘇省境內(nèi)，各個地市每年都能檢測到該病毒的發(fā)病，比對這些病毒序列后發(fā)現(xiàn)，流行的毒株主要屬于C4a亞型。這些感染EV71的患者發(fā)病情況越來越嚴(yán)重，且越來越多出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。因此加強對我國EV71流行狀況的調(diào)查及主要毒株的基因特征分析，對有效防控手口足病的流行具有重要意義。我們對1株腸道病毒71型南京分離株進行了分離和基因組全長測序，并對全長序列進行了遺傳進化分析，以期為EV71的基因特征及流行病學(xué)研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；DL2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物、RNA酶抑制劑（TaKaRa公司）；瓊脂糖、水飽和酚、氯仿、異丙醇、DEPC（Sigma公司）；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司）；PCR凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和2×Taq PCR酶（北京天根公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.2 標(biāo)本來源

標(biāo)本取自南京市兒童醫(yī)院2012年入院治療經(jīng)臨床確診為手口足病并伴發(fā)重癥腦炎的1例患者糞便及皰疹液樣本。經(jīng)病毒微量中和試驗及RT-PCR方法檢驗確診后，將該株病毒命名為EV71-NJ2012，置于－70℃保存。

1.3 引物設(shè)計及合成

根據(jù)基因庫中登錄的EV71的全基因組序列，用CLUSTAL-W（V1.8）進行序列比對，找出保守區(qū)域，設(shè)計8對首尾相互重疊且覆蓋基因組全長的引物進行擴增（表1）。引物由上海生工生物技術(shù)公司進行合成。

表1 EV71-NJ2012全基因組分段擴增引物

1.4 病毒RNA的提取及擴增

病毒樣品在Vero細胞進行繁殖后收集病毒，用Trizol試劑進行裂解后提取病毒RNA，最后溶解到DEPC溶液中。然后以病毒RNA為模板分別用表1中的8對引物，分8段用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和PCR酶進行RT-PCR反應(yīng)，合成病毒cDNA。PCR反應(yīng)條件為94℃30 s，53℃30 s，72℃1 min，32個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確認。

1.5 擴增片段的克隆、測序及遺傳進化分析

對經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認后的8個片段分別進行純化回收，目的DNA連接至T載體后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，涂布平板過夜生長后挑取克隆進行質(zhì)粒提取，獲得的質(zhì)粒送深圳華大基因公司進行測序。測得的序列與基因庫中登錄的序列進行在線比對進一步確認，然后用CLUSTAL-W（V 1.8）軟件進行序列比對，計算核苷酸序列的同源性，用MEGA 4.0軟件構(gòu)建遺傳進化樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物的擴增及鑒定

從樣品中提取病毒RNA，分別用對應(yīng)的引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得對應(yīng)的cDNA片段，以此為模板用設(shè)計的引物分別進行PCR擴增，獲得覆蓋整個EV71病毒株基因組并且相鄰片段之間有部分序列相互重疊的基因片段，最后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。RT-PCR結(jié)果表明，用設(shè)計的8對引物分別擴增后均得到預(yù)計片段大小，擴增片段長度覆蓋整個EV71病毒株基因組。

2.2 EV71-NJ2012全基因組序列的測定及分析

將獲得的8段PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收及克隆到載體上后進行測序，測序結(jié)果經(jīng)序列拼接、比對及分析后獲得EV71-NJ2012的全基因組序列。EV71-NJ2012病毒株全基因組序列長度為7 404 bp（不含多聚腺苷酸尾長度），其中堿基A占27.17%，U占24.84%，G占23.81%，C占24.18%，胸腺嘧啶和尿嘧啶含量豐富（A＋U＝52.01%）。其中基因組1～741 bp為5′非編碼區(qū)，742～7 323 bp為病毒基因組的編碼區(qū)，編碼一個多聚蛋白，最后為病毒的3′非編碼區(qū)。與其他地區(qū)分離的EV71毒株相比，EV71-NJ2012株在中間的多聚蛋白區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)核苷酸的插入和缺失，但在5′UTR和3′UTR均發(fā)現(xiàn)有核苷酸的插入。

2.3 病毒全基因組序列核苷酸同源性比較

為了進一步分析EV71-NJ2012株與其他EV71型代表性毒株的同源性，對來自國內(nèi)主要省份及國外代表性毒株基因組不同區(qū)段的核苷酸同源性進行了比較。經(jīng)過分析病毒的基因組結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，EV71-NJ2012病毒株無論是在病毒的結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域還是在病毒的非編碼區(qū)（5′UTR和3′UTR），與遼寧、福建及上海株的同源性較高，其中與EV71上海株（收錄號：HQ891929）的同源性高達98.2%，與浙江、福建等省份分離的毒株的同源性次之，與湖北分離株（收錄號：DQ452074）的同源性為最低（表2）。

表2 EV71-NJ2012株與其他代表性EV71型分離株核苷酸序列的同源性比較 %

2.4 病毒基因組的遺傳進化分析

用DNAStar（V 7.0）和CLUSTAL-W（V 1.8）軟件進行核苷酸序列比對，用MEGA 4.0軟件構(gòu)建遺傳進化樹。結(jié)果表明，EV71-NJ2012南京分離株與上海分離株在同一進化分支，屬于C4a基因型，進一步證實EV71-NJ2012南京分離株與上海分離株的親緣關(guān)系（圖1）。

3 討論

EV71屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，基因組全長7 400 bp左右，為單股正鏈RNA病毒。2008年以來，EV71型的感染在我國呈暴發(fā)趨勢，并且在多個省份出現(xiàn)病例死亡的報道。為了解南京地區(qū)近年來EV71型毒株的病原特征，我們對2012年分離到的1株EV71型病毒株進行了全基因組序列的測定及同源性分析，并繪制了遺傳進化樹，對病毒序列進行親緣關(guān)系分析，以期了解南京分離株的遺傳進化關(guān)系。

圖1 EV71-NJ2012南京分離株全基因組序列的遺傳進化樹

經(jīng)全基因組序列的測定及分析，發(fā)現(xiàn)該病毒分離株多聚蛋白區(qū)域比較保守，沒有核苷酸及氨基酸的插入和缺失，但是非編碼區(qū)基因的變異較為明顯，這與國內(nèi)其他省份的報道相符［6－7］。南京地區(qū)分離的EV71型病毒株EV71-NJ2012為C4a亞型，與近年來國內(nèi)主要流行毒株基因型一致。在核苷酸的同源性方面，EV71-NJ2012病毒株與上海、福建、遼寧、浙江及廣西分離株有較高的同源性，其中與上海分離株的同源性最高，同屬于C4基因型。這說明分離到的病毒株較為穩(wěn)定，沒有發(fā)生較大的變異。南京與上海有較近的地緣，人員往來較為頻繁，為病毒在兩地的快速傳播提供了便利條件。分段序列比對發(fā)現(xiàn)，EV71-NJ2012病毒株的結(jié)構(gòu)蛋白P1區(qū)與上海株的同源性最近，但是對P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的序列分析表明，EV71-NJ2012病毒株與浙江株有較近的親緣關(guān)系。

中國大陸地區(qū)EV71的流行多以C4為主，在感染的初期多表現(xiàn)為隱性感染，這給手口足病的監(jiān)測和防控帶來了一定的困難。目前針對該病尚無有效的疫苗和藥物，因此加強預(yù)防和監(jiān)測，掌握其分子流行病學(xué)特征和病原學(xué)特征，對防控本病顯得尤為重要。本研究對南京市1例手口足病患者的病毒分離株進行了全基因組序列的測定及遺傳進化分析，結(jié)果表明該病毒株屬于C4a基因型，為我國EV71病毒基因庫積累了相關(guān)資料，也為以后疫苗的研制、診斷試劑的開發(fā)及防控策略的制定提供了重要參考。

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Sequence and phylogenetic analysis of an enterovirus71 strain isolated in Nanjing

ZHOU-Jin1，CAO Xi-hua2，CAO Tong1，CHEN Hong-bing1
（1.Department of Clinical Laboratory，Children′s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 210008；2.Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College，Nanyang Henan 473058，China）

Objective：To sequence and analyze the complete genome of an enterovirus 71 isolate（EV71-NJ2012）isolated in Nanjing（2012），and to compare the sequences deposited in GenBank.M ethods：According to the genome information from GenBank，8 pairs of primerwere designed to cover thewhole genome.The genome sequences were determined by RT-PCR sequencingmethod，and the sequences were analyzed using bioinformatic software（MEGA 4.0 and DNAStar）.Results：The full genomic length of EV71-NJ2012 was 7 404 bp，which contained 5′UTR（742 bp），the open reading frame（ORF，6 582 bp）and 3′UTR（82 bp）.The ORF encoded a polyprotein with 2 193 amino acid residues.The viral sequences belong to the sub-type C4a genotype and had themaximum homology with Shanghai isolate，however，its sequencewas quite differentwith the Taiwan and Hubei isolates.Conclusion：The genome structure of EV71-NJ2012 strain is consistentwith enterovirus.The phylogenetic relationships of the EV71-NJ2012 strain with other EV71 strains are different.EV71-NJ2012 strain has themaximum sequence homology with Shanghai isolate，and is quite different with the Taiwan and Hubei isolates.It maybe infer that EV71-NJ2012 and Shanghai strains probably originate from the same EV71 strain.

hand-foot-mouth disease；enterovirus 71（EV71）；sequence analysis

周晉（1985—），男，江蘇南京人，技師，主要研究方向為病原學(xué)；陳紅兵（通訊作者），E-mail：115468172＠qq.com

R373.25

A

1671－7783（2014）04－0312－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140159

2014－04－29 ［編輯］陳海林