高亮，邰寧正

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

外源性一氧化碳釋放分子對大鼠隨意窄蒂皮瓣缺血 再灌注損傷的保護(hù)作用

高亮，邰寧正

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：觀察外源性一氧化碳釋放分子（CO-releasingmolecule-2，CORM-2）在皮瓣缺血再灌注損傷（ischemiareperfusion injury，IRI）過程中發(fā)揮的作用。方法：將大鼠隨機(jī)分為CORM-2組和對照組，每組各18只，設(shè)計隨意窄蒂皮瓣IRI模型，術(shù)后即刻尾靜脈注射CORM-2（8 mg／kg）；對照組：尾靜脈注射等量的生理鹽水。兩組每隔24 h給藥1次，直到術(shù)后第7天。術(shù)后24 h檢測兩組大鼠皮瓣組織勻漿液NF-κB活性；術(shù)后第3、5、7天分別檢測上述兩組皮瓣組織中丙二醛含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；大鼠心臟取血，檢測血清IL-6和TNF-α水平；術(shù)后第3、5、7天對兩組皮瓣蒂部進(jìn)行組織學(xué)檢查；拍照記錄并計算術(shù)后第7天兩組皮瓣的成活率。結(jié)果：①皮瓣術(shù)后第3、5、7天，與對照組比較，CORM-2組皮瓣組織中丙二醛含量明顯下降（P＜0.01），SOD活性明顯升高（P＜0.01）。②皮瓣術(shù)后第3、5、7天，CORM-2組血清中IL-6和TNF-α水平明顯降低（P＜0.01）。③術(shù)后24 h CORM-2組NF-κB活性明顯降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。④組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)CORM-2能明顯促進(jìn)皮瓣蒂部組織毛細(xì)血管增生。⑤皮瓣術(shù)后第7天，CORM-2組皮瓣成活率明顯高于對照組（P＜0.01）。結(jié)論：CORM-2可有效降低大鼠窄蒂皮瓣的IRI，明顯提高了皮瓣成活率。

CORM-2；窄蒂皮瓣；缺血再灌注損傷；丙二醛；超氧化物歧化酶；白介素-6；腫瘤壞死因子-α；NF-κB

狹長窄蒂皮瓣屬于一種特殊的隨意型皮瓣［1］，本質(zhì)上是由一個類似狹長皮瓣的蒂部（同樣不包含知名血管）攜帶一個具有一定長寬比的皮瓣所構(gòu)成的隨意型皮瓣。研究證明一定長寬比的狹長窄蒂所能攜帶的任意皮瓣成活面積有其最大值，超過該值后皮瓣遠(yuǎn)端會發(fā)生壞死［2－3］。導(dǎo)致壞死的根本原因是超范圍的皮瓣在術(shù)后存在缺血 再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）及因IRI引發(fā)的一系列炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。近年來國內(nèi)外的多種實(shí)驗研究顯示外源性一氧化碳釋放分子（CO-releasing molecule-2，CORM-2）在IRI［4］、膿毒癥引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)［5］等病理生理過程中發(fā)揮重要的生理作用，且具有明顯的抗炎作用［6］。但有關(guān)CORM-2在皮瓣中的應(yīng)用研究還未見報道。本研究構(gòu)建大鼠合適比例隨意型窄蒂皮瓣IRI模型，利用CORM-2進(jìn)行干預(yù)，觀察CORM-2對皮瓣存活的影響，探討CORM-2在窄蒂皮瓣IRI過程中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康成年SD大鼠36只，雌雄不限，體質(zhì)量（250±19）g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。隨機(jī)將大鼠分為CORM-2組和對照組，每組18只。單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，室溫控制在25℃左右，濕度40%～60%。

1.2 皮瓣IRI模型制備

術(shù)前1 d，8%Na2S溶液脫毛，備皮范圍4～10 cm，實(shí)驗前一夜禁食。腹腔注射10%水合氯醛（4 mL／kg）麻醉，大鼠俯臥位固定。將蒂設(shè)計在模型尾側(cè)，蒂長寬為1.5 cm×1 cm，瓣長寬為6 cm×1.5 cm，手術(shù)達(dá)深筋膜，掀起皮瓣組織后，在皮瓣基底鋪一次性潔凈無菌保鮮膜，3-0手術(shù)縫合線原位縫合。

1.3 給藥方法

CORM-2組：術(shù)后即刻尾靜脈注射CORM-2（8 mg／kg）；對照組：尾靜脈注射等量的生理鹽水。兩組每隔24 h給藥1次，直到術(shù)后第7天。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 皮瓣組織NF-κB活性的檢測 術(shù)后24 h取大鼠皮瓣中部組織，按照組織勻漿方法進(jìn)行勻漿和離心，提取核蛋白，采用蛋白印跡法檢測NF-κB的活性。試劑為兔NF-κB p65多抗（美國Santa Cruz公司）。

1.4.2 皮瓣組織丙二醛含量和SOD活性檢測 術(shù)后第3、5、7天分別取CORM-2組和對照組皮瓣中部組織，勻漿取上清液，根據(jù)1∶4比例用生理鹽水進(jìn)行稀釋，得到2%的組織勻漿。應(yīng)用硫代巴比妥酸法檢測皮瓣組織丙二醛的含量，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD的活性。

1.4.3 血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-6水平的測定 術(shù)后第3、5、7天從大鼠心臟取血，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測血清TNF-α和IL-6含量，具體步驟參考ELISA試劑盒（南京建成生物技術(shù)公司）說明書。

1.4.4 組織學(xué)觀察 術(shù)后第3、5、7天分別取CORM-2組和對照組皮瓣的蒂部0.5 cm×0.2 cm全厚皮瓣組織，以4%低聚甲醛固定，石蠟包埋切片、HE染色。

1.4.5 皮瓣成活率 術(shù)后第7天采用高清數(shù)碼相機(jī)對皮瓣存活情況進(jìn)行拍照，圖像輸入計算機(jī)，用Image-Pro P1us 7.0圖像分析軟件分析，并計算成活率。成活率＝存活面積／皮瓣總面積×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮瓣組織NF-κB活性

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，對照組大鼠皮瓣組織中NF-κB與β-肌動蛋白的比值為1.2±0.14；尾靜脈注射CORM-2干預(yù)后，大鼠皮瓣組織中NF-κB與β-肌動蛋白的比值為0.5±0.07，明顯低于對照組（t＝6.083，P＜0.01）。見圖1。

圖1 兩組大鼠皮瓣組織中NF-κB的表達(dá)

2.2 皮瓣組織丙二醛含量、SOD活性

與對照組比較，在第3、第5、第7天各時間點(diǎn)CORM-2組大鼠皮瓣組織丙二醛含量明顯下降（P＜0.01），而SOD活性明顯升高（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組大鼠皮瓣組織各時間點(diǎn)SOD活性和丙二醛含量的比較 ±s，n＝18

表1 兩組大鼠皮瓣組織各時間點(diǎn)SOD活性和丙二醛含量的比較 ±s，n＝18

分組 SOD（nmol／kg ） 丙二醛（nmol／kg ）第3天 第5天 第7天 第3天 第5天 第7天7 4.67±0.64 2.99±0.72 CORM-2組 56.93±3.70 47.22±6.32 72.72±2.28 4.15±0.36 3.47±0.36 2.25±0.16 t值對照組 44.89±3.51 33.20±5.40 53.73±11.74 5.90±0.2 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 7.952 6.269 6.012 6.369 7.698 6.874 P值

2.3 血清IL-6和TNF-α含量的變化

與對照組比較，CORM-2組大鼠各時間點(diǎn)血清TNF-α和IL-6含量均明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組大鼠各時間點(diǎn)血清IL-6和TNF-α含量的變化 ±s，n＝18

表2 兩組大鼠各時間點(diǎn)血清IL-6和TNF-α含量的變化 ±s，n＝18

分組 IL-6（nmol／kg ）TNF-α（nmol／kg ）第3天 第5天 第7天 第3天 第5天 第7天64.56±3.92 144.62±3.87 CORM-2組 0.84±0.08 0.62±0.07 0.57±0.04 140.77±3.36 111.80±4.96 99.10±5.74 t值對照組 1.05±0.09 0.94±0.09 0.89±0.07 189.84±5.68 1 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 7.063 7.986 6.996 10.95 11.58 9.698 P值

2.4 皮瓣組織的病理形態(tài)

術(shù)后第3天，CORM-2組大鼠皮瓣蒂部未見明顯變化，無明顯腫脹，可見少許新生毛細(xì)血管；對照組皮瓣蒂部表皮下組織略微水腫，可見中性粒細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管增生不明顯。術(shù)后第5天，CORM-2組大鼠皮瓣蒂部新生毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多；對照組皮瓣蒂部水腫不明顯，可見少量中性粒細(xì)胞浸潤，未見明顯的毛細(xì)血管增生。術(shù)后第7天，CORM-2組可見豐富的毛細(xì)血管增生，明顯多于對照組，且可見少數(shù)血管管徑變大，蒂部充血。見圖2。

圖2 兩組大鼠術(shù)后不同時間的皮瓣組織病理形態(tài)（HE染色×200）

2.5 皮瓣存活率

術(shù)后第7天，記錄CORM-2和對照組各自大鼠皮瓣的成活情況。結(jié)果顯示，對照組皮瓣平均存活率為52.72%，CORM-2組皮瓣平均存活率為77.22%，CORM-2組平均存活率較對照組提高24.50%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝7.062，P＜0.01）。

3 討論

3.1 窄蒂皮瓣IRI模型的選擇

大鼠容易飼養(yǎng)且手術(shù)操作和術(shù)后處理較為簡單，因此常作為皮瓣實(shí)驗研究的動物模型。根據(jù)王法剛等［7］對大鼠背部血流分布和實(shí)驗研究分析，我們選擇大鼠背部的中心線為皮瓣的軸線，將蒂部放在尾側(cè)的皮瓣模型更穩(wěn)定可靠。趙天蘭等［2－3］證實(shí)，一定長寬比的狹長窄蒂所能攜帶的任意皮瓣成活面積有其最大值，超過限制范圍，皮瓣遠(yuǎn)端即會存在血運(yùn)障礙。故本實(shí)驗?zāi)Ｐ筒捎么笫蟊巢恐行木€作為皮瓣軸線，窄蒂位于尾側(cè)；選擇的蒂長寬比為1.5 cm∶1 cm，瓣長寬比為6 cm∶1.5 cm，缺血隨意皮瓣模型穩(wěn)定。

3.2 CORM-2對大鼠隨意窄蒂皮瓣IRI的保護(hù)作用

3.2.1 CORM-2能改善皮瓣蒂部血供 隨意窄蒂皮瓣術(shù)后，首先對皮瓣成活造成最大影響的就是血供。研究顯示皮瓣成活的長度與皮瓣內(nèi)的血流灌注壓密切相關(guān)［8］。由于本實(shí)驗是通過創(chuàng)底鋪置保鮮膜干預(yù)創(chuàng)底創(chuàng)緣的血供，因此蒂部的血供改善在皮瓣的成活過程中尤為關(guān)鍵。我們在術(shù)后第3、5、7天取皮瓣蒂部組織切片進(jìn)行HE染色，光鏡下發(fā)現(xiàn)CORM-2組皮瓣蒂部肉芽組織開始增生，新生毛細(xì)血管明顯，且可見少數(shù)血管管徑變大，蒂部充血量豐富。對照組較CORM-2組毛細(xì)血管數(shù)量少，少數(shù)亦表現(xiàn)出輕微玻璃樣壞死。同時，我們在切取蒂部組織時發(fā)現(xiàn)CORM-2組蒂部切開時有明顯出血，色澤鮮艷。而對照組只有少數(shù)樣本出血，且出血量明顯少于CORM-2組。這一現(xiàn)象與光鏡下結(jié)果相符。在術(shù)后第7天，經(jīng)圖像分析數(shù)碼相機(jī)記錄的兩組皮瓣成活情況，顯示CORM-2組平均存活率較對照組明顯提高。

結(jié)果證明CORM-2在隨意窄蒂皮瓣缺血損傷過程中參與皮瓣血管形成、血管擴(kuò)張、血液循環(huán)調(diào)節(jié)，增加蒂部血流，提高皮瓣內(nèi)血流灌注壓，血液走行路徑得到延長、分布面積擴(kuò)大，從而改變了皮瓣遠(yuǎn)端血供狀況，縮小遠(yuǎn)端壞死比例，使皮瓣的成活率得到明顯提高。

3.2.2 CORM-2具有抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用 郭樹忠等［9］的研究表明，隨意皮瓣手術(shù)后缺血 再灌注時，皮瓣組織產(chǎn)生大量的自由基，進(jìn)而對皮瓣造成損傷，并發(fā)現(xiàn)皮瓣組織中的SOD活性和丙二醛含量之間存在負(fù)相關(guān)。在皮瓣IRI過程中，自由基生成逐漸增加，從而導(dǎo)致丙二醛含量隨之增加。由于生成的自由基對SOD有攻擊性，致SOD的活性下降，導(dǎo)致組織內(nèi)的自由基不能得到有效清除。而自由基的堆積會放大脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使丙二醛含量進(jìn)一步升高，從而形成了一種惡性循環(huán)。SOD失活即意味著其對皮瓣組織的保護(hù)作用喪失。通過局部進(jìn)行外源性SOD灌注能明顯提高皮瓣的成活率。由此表明，SOD對皮瓣組織在缺血再灌注時所產(chǎn)生的大量自由基的清除是至關(guān)重要的。杜佳梅等［10］以及周力純等［11］的研究也證實(shí)了皮瓣術(shù)后組織自由基明顯增多，氧化應(yīng)激反應(yīng)程度升高，且對皮瓣的成活情況有明顯影響。

我們在術(shù)后第3、5、7天分別取CORM-2組和對照組皮瓣中部組織進(jìn)行勻漿，檢測組織中抗氧化酶SOD和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛，以明確反映機(jī)體在術(shù)后抗氧化能力及氧化應(yīng)激程度，從而間接反映兩組皮瓣損傷程度的區(qū)別。實(shí)驗結(jié)果顯示，與對照組比較，CORM-2組大鼠皮瓣中的丙二醛含量明顯降低，而SOD活性顯著升高，表明CORM-2在窄蒂皮瓣術(shù)后能有效對抗缺血 再灌注時產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，減輕自由基對皮瓣的損傷，因此對皮瓣具有保護(hù)作用。

3.2.3 CORM-2的抗炎癥反應(yīng)作用 大量研究表明，再灌注時炎癥的激發(fā)和級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)了繼發(fā)性損害，這是皮瓣缺血壞死的又一重要原因。TNF-α是機(jī)體內(nèi)一種重要的促炎癥細(xì)胞因子，IL-6是機(jī)體對感染和組織損傷所引起反應(yīng)的主要介質(zhì)。創(chuàng)傷后巨噬細(xì)胞分泌大量TNF-α和IL-6，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，在創(chuàng)傷等應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體TNF-α和IL-6水平明顯升高［12－13］，導(dǎo)致多種炎癥因子瀑布式釋放，造成血管內(nèi)皮功能障礙。

細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達(dá)量在缺血損傷時明顯上調(diào)，再灌注時白細(xì)胞表面的整合素與其結(jié)合，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞表面大量的白細(xì)胞黏附聚集，釋放一系列的炎癥因子和自由基，損傷血管內(nèi)皮，加重IRI［14－15］。研究顯示NF-κB是一種信號傳導(dǎo)途徑中的核內(nèi)反應(yīng)信號分子，可誘導(dǎo)細(xì)胞因子、內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子、單核細(xì)胞趨化因子的轉(zhuǎn)錄合成，促進(jìn)炎性信號的級聯(lián)擴(kuò)大，最終導(dǎo)致機(jī)體的多器官損傷。大鼠皮瓣在掀起后，就產(chǎn)生了缺血 再灌注損傷，機(jī)體相應(yīng)釋放大量的炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)，從而造成對皮瓣組織的直接損害。實(shí)驗結(jié)果顯示術(shù)后24 h CORM-2組皮瓣組織NF-κB表達(dá)明顯降低，且術(shù)后第3、5、7天TNF-α和IL-6血清水平明顯降低（P＜0.01），說明CORM-2在大鼠窄蒂皮瓣IRI模型中對炎癥反應(yīng)起到重要的抑制作用，可減輕IRI對皮瓣組織的損傷。本課題組前期在膿毒癥實(shí)驗研究中證實(shí)CORM-2具有抑制NF-κB活性和內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的作用［16］。因此，我們推測CORM-2在大鼠皮瓣IRI過程中發(fā)揮了同樣的調(diào)控作用，抑制NF-κB的表達(dá)與活化，繼而下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)，有效減少炎癥因子的釋放，降低炎癥反應(yīng)對組織的損傷；抑制中性粒細(xì)胞、血小板在血管內(nèi)皮上的黏附聚集，并減少自由基的釋放，對血管內(nèi)皮起到一定的保護(hù)作用，促進(jìn)皮瓣組織的成活。

綜上所述，在大鼠皮瓣IRI中，CORM-2釋放的CO作為一種血管調(diào)節(jié)因子，具有擴(kuò)張血管、促進(jìn)新生毛細(xì)血管形成、增加血供的作用；CO可明顯抑制NF-κB活性，減少前炎癥細(xì)胞因子的釋放，減輕白細(xì)胞對組織和血管內(nèi)皮的浸潤黏附，對血管內(nèi)皮起到間接保護(hù)作用；CO在產(chǎn)生抗炎反應(yīng)的同時，減少了炎性細(xì)胞釋放自由基，進(jìn)而避免了IRI過程中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的放大，對組織起到保護(hù)作用。

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Protection of CO-releasing molecules-2 against the random narrow pedicle skin flap w ith ischem ia-reperfusion injury in rats

GAO Liang，TAINing-zheng
（Department of Burns and Plastic Surgery，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To observe the effect of CO-releasingmolecules-2（CORM-2）on the random narrow pedicle skin flap in the SD ratswith ischemia-reperfusion injury（IRI），and discuss the possiblemechanism.M ethods：Established IRImodels of random narrow pedicle skin flap in rats.A total of 36 SD rats were divided into two groups at random：CORM-2 group，models of random narrow pedicle skin flap and treated by CORM-2；NS group，models of random narrow pedicle skin flap and treated by normal saline（NS）.Test the activity of NF-κB byWestern blotting.The content ofmalonaldehyde（MDA）in tissue of skin flap was detected by phenobarbitone acid；the activity of superoxide dismutase（SOD）in tissue of skin flap was detected by xanthine oxidase；the level of IL-6 and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in blood serum was detected by ELISA；pathological changes were observed with lightmicroscope in the 3rd，5th，7th day after operation；survival rate of skin flap was the average survival length of skin flap deciding practical length of skin flap.Results：①The skin flap uncovered by the 3rd，5th，7th day，compared with NSgroup，the content of MDA in the skin flap of CORM-2 group lower（P＜0.01），the activity of SOD significantly increased（P＜0.01）.②The skin flap uncovered by 3rd，5th，7th day，compared with NS group，the level of IL-6 and TNF-αin blood serum lower（P＜0.01）.③Histopathology showed that abundant capillary were no-ticed by application of CORM-2.④CORM-2 can effectively restrain the NF-κB activation in random narrow pedicle skin flap model.⑤The skin flap was uncovered by the 7th day，compared with NSgroup，survival rate of skin flap of CORM-2 group significantly higher（P＜0.01）.Conclusion：CORM-2 effectively reduced the narrow pedicle skin flap of ratswith IRI，and improved the survival rate of flap.

CO-releasing molecule-2；random narrow pedicle skin flap；ischemia reperfusion injury；malonaldehyde；superoxide dismutase；IL-6；tumor necrosis factor-α；NF-κB

R965.1

A

1671－7783（2014）04－0307－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140034

國家自然科學(xué)基金資助項目（30772256，81272148）

高亮（1988—），男，碩士研究生；邰寧正（通訊作者），副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：710204914＠qq.com

2014－01－21 ［編輯］陳海林