王哲鑫，吉瀅，趙昕，徐順高，黃新祥

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

非編碼小RNA T64對傷寒沙門菌基因表達(dá)的影響

王哲鑫，吉瀅，趙昕，徐順高，黃新祥

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：對由轉(zhuǎn)錄組測序獲得的傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi）非編碼小RNA（small non-coding RNA，snRNA）T64的表達(dá)進(jìn)行驗證，并對其功能進(jìn)行初步探討。方法：選取特異性引物采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和普通PCR確認(rèn)T64在S.Typhi中的表達(dá)；將含有T64 snRNA序列的重組質(zhì)粒導(dǎo)入S.Typhi野生株構(gòu)建T64高表達(dá)株；結(jié)合應(yīng)用S.Typhi全基因組芯片分析技術(shù)，比較S.Typhi T64高表達(dá)株和空載體對照株在對數(shù)期基因表達(dá)譜差異，并對部分基因芯片結(jié)果進(jìn)行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證。結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示，snRNA T64在S.Typhi確有表達(dá)；基因芯片分析結(jié)果顯示，與空載體對照株比，snRNA T64高表達(dá)株在對數(shù)期有20個基因表達(dá)上調(diào)，7個下調(diào)；4個被選基因表達(dá)的qRT-PCR結(jié)果與芯片分析結(jié)果相符。結(jié)論：snRNA T64在S.Typhi中表達(dá)，可能在基因的表達(dá)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

傷寒沙門菌；非編碼小RNA；基因芯片分析；實時熒光定量PCR；基因表達(dá)調(diào)節(jié)

近年來，人們對生物體內(nèi)非編碼小RNA（small non-coding RNA，snRNA）的研究日益增多。snRNA作為新的基因表達(dá)調(diào)控因子的作用也引起了重視［1］。轉(zhuǎn)錄組測序是發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中snRNA的強(qiáng)有力手段，結(jié)合生物信息學(xué)學(xué)者們發(fā)現(xiàn)和證實了150余種snRNA，主要存在于大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）、銅綠假單胞菌、霍亂弧菌等細(xì)菌中［2］。這些snRNA大多通過不完全配對方式與一個或多個靶基因的mRNA堿基形成互補(bǔ)配對［3－5］，于轉(zhuǎn)錄后水平影響基因的表達(dá)［6］，在細(xì)菌生長、代謝、應(yīng)激等生命過程中發(fā)揮重要作用［7－8］。

借助前期對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析，我們預(yù)測傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi）中存在一個新的snRNA，命名為T64。本文將對T64 snRNA的表達(dá)進(jìn)行驗證，并應(yīng)用S.Typhi全基因組DNA芯片［5］和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)，分析其對S.Typhi基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 S.Typhi野生株GIFU10007由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物系饋贈；E.coli TOP-10、E.coli DH5α由本實驗室保存；snRNA高表達(dá)所用質(zhì)粒pBAD／Myc-His A為Promega公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要材料與試劑 NcoⅠ和Hin dⅢ限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA酶Ⅰ、r Taq酶、Ex Taq DNA聚合酶、TA克隆試劑盒均購自大連TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；總RNA提取試劑盒、cDNA純化試劑盒購自Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司；熒光標(biāo)記染料Cy3／Cy5-dCTP購自Amersham公司；qRT-PCR 96孔板購自Bio-Rad公司；S.Typhi基因組芯片為本實驗室自制［9］。

1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀（ABI公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Syngene公司）；ND-100核酸檢測儀（NanoDrop公司）；CFX96TM實時熒光定量系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；Gene PulseroⅡ電轉(zhuǎn)化儀（Bio-Rad公司）；Genepix personal 4100A基因芯片掃描儀（Axon公司）。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計 使用Oligo 6.0軟件設(shè)計引物，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析和生物信息學(xué)分析得到snRNA T64的上下游序列，分別設(shè)計帶有NcoⅠ和Hin dⅢ酶切位點的特異性引物64FP／64RP。根據(jù)S.Typhi基因組序列，分別設(shè)計lctD、invF、sopE和rbsB基因的特異性引物，用于qRT-PCR。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，序列詳見表1。

表1 引物的序列及用途

1.2.2 RT-PCR驗證T64表達(dá) 選取LB平板培養(yǎng)的S.Typhi野生株，溶于雙蒸水后煮沸10 min，12 000 r／min離心10 min，取上清作為細(xì)菌基因組的DNA模板，作為PCR對照。提取野生株總RNA，利用snRNA T64特異性引物PB反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。接著以特異性引物T64 PA／T64 PB作為PCR引物，分別以水，總RNA，基因組DNA，cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。

1.2.3 S.Typhi T64高表達(dá)株構(gòu)建 以S.Typhi野生株基因組DNA為模板，用64FA／64FB引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到帶有NcoⅠ和Hin dⅢ雙酶切位點的產(chǎn)物片段。用NcoⅠ和Hin dⅢ對擴(kuò)增產(chǎn)物片段和質(zhì)粒pBAD／Myc-His A進(jìn)行雙酶切，然后用T4連接酶將片段和質(zhì)粒連接，并導(dǎo)入E.coli DH5α。用Axygen試劑盒提取質(zhì)粒，作酶切和PCR初步驗證，最后經(jīng)上海生工生物工程有限公司基因測序確證T64高表達(dá)株制備成功。同樣用pBAD空質(zhì)粒導(dǎo)入野生株作為對照。

1.2.4 總RNA提取 取T64高表達(dá)株和空載體對照株的單菌落各1個，分別接種于2 mL LB培養(yǎng)液中，37℃，250 r／min培養(yǎng)18 h；再取300μL過夜菌液轉(zhuǎn)接入30 mL LB培養(yǎng)液（1∶100），以相同條件培養(yǎng)至對數(shù)生長期［D（600 nm）＝0.4］；每管中加入L-阿拉伯糖（終質(zhì)量濃度為0.5 mg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)30 min，誘導(dǎo)T64表達(dá)；4℃，10 000 r／mm，離心2 min收集菌體；提取兩株細(xì)菌總RNA，加DNA酶Ⅰ于37℃孵育30 min，以去除殘留基因組DNA；再于80℃孵育3 min以滅活DNA酶Ⅰ；最后用核酸檢測儀測RNA的濃度以及D（260 nm）／D（230 nm）比值。取3～5μg樣品，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA質(zhì)量和基因組DNA殘留情況［9］。

1.2.5 RNA反轉(zhuǎn)錄及基因組芯片分析 RNA反轉(zhuǎn)錄及基因組芯片分析方法參考文獻(xiàn)［9］進(jìn)行，各取高表達(dá)株和空載體對照株RNA 30μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并用Cy3／Cy5配對互標(biāo)cDNA；純化標(biāo)記好的cDNA，于42℃與S.Typhi基因組芯片雜交12 h；基因芯片掃描儀掃描后，通過軟件GenePix Pro 6.0將熒光信號數(shù)據(jù)化和標(biāo)準(zhǔn)化，最后用Excel進(jìn)行比對分析。

高表達(dá)株的基因表達(dá)熒光信號值／對照株的基因表達(dá)熒光信號值，取log2表示這兩株中基因表達(dá)差異的程度。log2為正值，表示基因表達(dá)在高表達(dá)株中上調(diào)；反之，負(fù)值則為下調(diào)。以數(shù)據(jù)log2絕對值≥1為篩選閾值。

1.2.6 qRT-PCR分析 細(xì)菌RNA提取方法同上，取總RNA 4μg，各基因的特異性下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再用基因上下游特異性引物進(jìn)行qRT-PCR［9］。實驗重復(fù)3次，每次各做3個平行。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S.Typhi snRNA T64表達(dá)驗證

見圖1，第4泳道擴(kuò)增產(chǎn)物長度為155 bp，與設(shè)計的T64特異性片段長度一致，且與第3泳道結(jié)果一致；第1、2泳道無特異片段產(chǎn)物。結(jié)果提示，S.Typhi確實有snRNA T64的表達(dá)。

2.2 S.Typhi snRNA T64高表達(dá)株的制備

PCR擴(kuò)增得到帶有NcoⅠ和Hin dⅢ雙酶切位點的產(chǎn)物片段P1，長度為150 bp。酶切和PCR初步驗證顯示，在疑似陽性質(zhì)粒中有目的酶切片段。最后經(jīng)測序分析證實，重組質(zhì)粒制備成功。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入S.Typhi野生株，獲得snRNA T64高表達(dá)株。見圖2。

圖1 RT-PCR驗證S.Typhi snRNA T64表達(dá)

圖2 S.Typhi snRNA T64高表達(dá)株的制備結(jié)果

2.3 S.Typhi snRNA T64高表達(dá)株和pBAD／Myc-His A對照株基因表達(dá)譜差異

結(jié)果顯示，與空載體對照株相比，snRNA T64高表達(dá)株有20個基因表達(dá)上調(diào)，7個基因表達(dá)下調(diào)。具體基因功能及表達(dá)變化見表2。

2.4 qRT-PCR驗證基因表達(dá)差異

挑選芯片分析有表達(dá)差異的4個基因進(jìn)行qRT-PCR驗證。結(jié)果顯示，高表達(dá)T64后，invF、sopE和rbsB基因表達(dá)均明顯上調(diào)，lctD基因表達(dá)明顯下調(diào)，提示qRT-PCR分析結(jié)果與芯片分析獲得的結(jié)果基本一致。見圖3。

3 討論

隨著RNA測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，越來越多的細(xì)菌snRNA被發(fā)現(xiàn)，其相應(yīng)的功能研究也已成為熱點。在我們的前期工作中，通過轉(zhuǎn)錄組和生物信息學(xué)分析，在S.Typhi發(fā)現(xiàn)了一個新的snRNA，命名為T64。本研究采用RT-PCR的方法第1次初步證實了其在S.Typhi中存在表達(dá)。我們通過構(gòu)建高表達(dá)株和空載體對照株，利用本實驗室建立的基因芯片平臺，觀察snRNA T64高表達(dá)后對細(xì)菌整體基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，27個基因表達(dá)有明顯變化，其中，20個基因表達(dá)上調(diào)，7個下調(diào)。采取qRTPCR對其中4個基因進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果與基因芯片結(jié)果基本相一致。

基因芯片分析結(jié)果顯示，表達(dá)差異的基因集中在與細(xì)菌毒力和代謝相關(guān)的基因，例如invF，一個重要的沙門菌致病島Ⅰ的毒力調(diào)節(jié)基因［10－12］，對sip家族基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用［13］。此外，還觀察到sipC基因表達(dá)上調(diào)，提示snRNA T64可能通過調(diào)控invF來參與細(xì)菌其他毒力基因的調(diào)節(jié)。另外，一些核糖體蛋白基因及酶基因的表達(dá)下調(diào)提示該snRNA T64在對數(shù)期參與S.Typhi的生長和代謝相關(guān)基因的調(diào)控。S.Typhi snRNAT64對invF和另外基因具體的作用機(jī)制目前尚不清楚，還需要深入研究。

總之，本研究進(jìn)一步驗證了S.Typhi存在snRNA T64表達(dá)；對其可能發(fā)生作用的靶基因進(jìn)行初步篩選，發(fā)現(xiàn)snRNA T64可能參與調(diào)節(jié)invF和其他基因的表達(dá)，在S.Typhi致病基因的表達(dá)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

表2 基因芯片分析snRNA T64高表達(dá)株與對照株基因表達(dá)差異結(jié)果

圖3 qRT-PCR驗證基因芯片分株結(jié)果

［1］Vogel J，Sharma CM.How to find small non-coding RNAs in bacteria［J］.Biol Chem，2005，386（12）：1219－1238.

［2］Sharma CM，Vogel J.Experimental approaches for the discovery and characterization of regulatory small RNA［J］.Curr Opin in Microbiol，2009，12（5）：536－546.

［3］Gottesman S.The small RNA regulators of Escherichia coli：roles and mechanisms［J］.Annu Rev Microbiol，2004，58：303－328.

［4］Wassarman KM.Small RNAs in bacteria：diverse regulators of gene expression in response to environmental changes［J］.Cell，2002，109（2）：141－144.

［5］Guillier M，Gottesman S.Remodelling of the Escherichia coli outer membrane by two small regulatory RNAs［J］.Mol Microbiol，2006，59（1）：231－247.

［6］Argaman L，Hershberg R，Vogel J.Novel small RNA-encoding genes in the intergenic regions of Escherichia coli［J］.Current Biology，2001，11（12）：941－950.

［7］Lenz DH，Mok KC，Lilley BN，et al.The small RNA chaperone Hfq and multiple small RNAs control quorum sensing in Vibrio harveyi and Vibrio cholerae［J］.Cell，2004，118（1）：69－82.

［8］Vogel J.A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella［J］.Mol Microbiol，2009，71（1）：1－11.

［9］Storz G，Opdyke JA，Zhang A.ControllingmRNA stability and translation with small non-coding RNAs［J］.Curr Opin Microbiol，2004，7（2）：140－144.

［10］生秀梅，黃新祥，茅凌翔，等.傷寒沙門菌基因組DNA芯片的制備與基因表達(dá)譜分析應(yīng)用［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36（2）：206－212.

［11］Darwin KH，Miller VL.Molecular basis of the interaction of Salmonella with the intestinal mucosa［J］.Clin Microbiol Rev，1999，12（3）：405－428.

［12］Daly RA，Lostroh CP.Genetic analysis of the Salmonella transcription factor HilA［J］.Can JMicrobiol，2008， 54（10）：854－860.

［13］Darwin KH，Miller VL.TypeⅢsecretion chaperone-dependent regulation：activation of virulence genes by SicA and InvF in Salmonella typhimurium［J］.EMBO J，2001，20（8）：1850－1862.

Influence of snRNA T64 on gene expression in Salmonella enterica serovar Typhi

WANG Zhe-xin，JIYing，ZHAO Xin，XU Shun-gao，HUANG Xin-xiang
（School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To identify the expression of samll non-coding RNA（snRNA）T64 detected by transcriptome sequencing in Salmonella enterica serovar Typhi（S.Typhi）and explore its functions preliminarily.M ethods：The native expression of snRNA T64 in S.Typhi was confirmed by reverse transcription PCR（RT-PCR）and PCR with specific primers.Overexpression strain of snRNA was constructed by transforming a recombinant plasmid containing sequence of snRNA T64 to the wild type strain of S.Typhi.Microarray was used to analyse the gene expression difference between overexpression strain and control strain in logarithmic growth phase.Some microarray results were confirmed by quantitative real-time PCR（qRTPCR）.Results：The expression of snRNA T64 was confirmed by the RT-PCR.The results ofmicroarray assay revealed that there were 20 genes expression upregulated in the overexpression strain of snRNA T64，while 7 genes expression downregulated，compared with the control strain in logarithmic growth phase.qRTPCR results of expressions of4 selected genesmatched themicroarray results.Conclusion：There were expression of snRNA T64 in S.Typhi，which might play important roles in gene expression regulation.

Salmonella enterica serovar Typhi；small non-coding RNA；microarray assay；quantitative real-time PCR；gene expression regulation

R516.3

A

1671－7783（2014）04－0298－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140092

王哲鑫（1986—），男，碩士研究生；黃新祥（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：huxinx＠yahoo.com.hk

2014－04－08 ［編輯］劉星星