蔣留留，賈浩源，祝源，尹磊，李里明，葉惠慧，薛建國，許文榮，錢暉

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

臍帶間質(zhì)干細(xì)胞來源的外切體對順鉑誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)作用

蔣留留，賈浩源，祝源，尹磊，李里明，葉惠慧，薛建國，許文榮，錢暉

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：研究人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞來源的外切體（hucMSC-Ex）對順鉑誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞損傷的修復(fù)作用，并探討可能的作用機(jī)制。方法：體外建立順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷模型，實(shí)驗(yàn)組以16μmol／L濃度的順鉑作用HK-2細(xì)胞16 h，再加入hucMSC-Ex共培養(yǎng)，同時選擇人肺成纖維細(xì)胞的外切體（HFL1-Ex）為對照，8 h后采用蛋白質(zhì)印跡法和FITC-Tunel技術(shù)檢測hucMSC-Ex對損傷HK-2細(xì)胞的抗凋亡和促增殖情況。未經(jīng)任何處理的HK-2細(xì)胞作為正常對照組，單純順鉑損傷并加等量PBS為PBS對照組。結(jié)果：成功建立了順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷體外模型，蛋白質(zhì)印跡分析顯示hucMSC-Ex處理改善了順鉑對HK-2細(xì)胞的損傷，凋亡蛋白Bax表達(dá)降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)相應(yīng)升高。FITC-Tunel檢測也顯示HK-2細(xì)胞的凋亡明顯減弱。而MTT分析顯示hucMSC-Ex處理后，HK-2細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。結(jié)論：HucMSC-Ex對順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷有一定的修復(fù)效果，可能是通過促進(jìn)HK-2細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

外切體；順鉑；人腎小管上皮細(xì)胞；增殖；凋亡

外切體（exosome）是一種可由多種細(xì)胞分泌的直徑40～100 nm的膜性小囊泡，是細(xì)胞與細(xì)胞，器官與器官之間信息傳遞的重要載體［1］。近年來間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）分泌的外切體（MSC-Ex）成為組織再生修復(fù)的新研究熱點(diǎn)［2］。多個研究證實(shí)MSC-Ex在腎［3］、心［4］、神經(jīng)［5］、肺［6］等損傷中具有明確的修復(fù)作用。本課題組前期研究也揭示臍帶MSC來源的外切體（hucMSC-Ex）可減緩CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化并促進(jìn)其肝功能恢復(fù)［7］，對順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠模型也有明顯的修復(fù)效果［8］。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，構(gòu)建順鉑誘導(dǎo)的人腎近曲小管上皮細(xì)胞HK-2損傷模型，探討hucMSC-Ex對損傷腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)作用，并進(jìn)一步探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人近曲小管上皮細(xì)胞HK-2（美國菌種保存中心），人肺成纖維細(xì)胞HFL-1（中國科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫）。順鉑（中國德州制藥有限公司），胎牛血清（美國Gibco公司），DMEM／F-12培養(yǎng)基（HyClone，美國Thermol Fisher公司）；兔抗人Bax（美國Bioworld公司），兔抗人Bcl-2（美國Bioworld公司），抗GAPDH鼠單克隆抗體（北京康為世紀(jì)公司），Tunel-FITC試劑盒（美國Vazyme公司），DAPI（瑞士Roche公司）。倒置熒光顯微鏡（Ti-S，日本Nikon公司），高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（美國Molecular Devices公司）。CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），全自動滅菌鍋（日本Tomy公司），超低溫冰箱（美國Forma公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（ImageQuantLAS4000mini，美國GE公司），熒光酶標(biāo)儀（FLX800TM，美國Bio-Tek公司）。

1.2 方法

1.2.1 外切體的分離鑒定 收集本實(shí)驗(yàn)室原代培養(yǎng)的人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)上清，采用改進(jìn)的超濾及梯度離心法分離并純化培養(yǎng)上清中的外切體。以人肺成纖維細(xì)胞HFL-1為細(xì)胞對照，同樣收集培養(yǎng)上清并分離外切體。分離的外切體經(jīng)電鏡表面標(biāo)記分析鑒定［7－8］。

1.2.2 順鉑損傷HK-2細(xì)胞模型的構(gòu)建及hucMSCEx處理 HK-2細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM／F-12培養(yǎng)基37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次，消化傳代后種于6孔培養(yǎng)板，每孔50 000個細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。①正常對照組：未經(jīng)任何處理的HK-2細(xì)胞；②順鉑＋PBS組：16μmol／L順鉑作用HK-2細(xì)胞16 h，撤去藥物加入20μL PBS（作為hucMSC-Ex同體積對照）再培養(yǎng)8 h；③順鉑＋hucMSC-Ex組：16μmol／L順鉑處理16 h，撤去藥物再加入hucMSC-Ex（100μg／mL，20μL）共培養(yǎng)8 h；④順鉑＋HFL1-Ex組：順鉑處理16 h后，撤藥加入HFL1-Ex（100μg／mL，20μL）8 h。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測Bax、Bcl-2蛋白 胰酶消化上述各組的HK-2細(xì)胞，離心收集后加入細(xì)胞組織裂解液充分裂解，然后加入1／4體積的5×SDS上樣緩沖液于蛋白裂解上清液中，沸水煮10 min。聚丙烯酰胺電泳，每孔上樣等量的總蛋白。分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）和GAPDH（1∶5 000）抗體稀釋液，4℃過夜。TBS／0.5% Tween20洗膜3次后，再加入1∶5 000抗HRP抗體稀釋液37℃孵育1 h，TBS、0.5%Tween20充分洗膜3次后，預(yù)混HRP化學(xué)發(fā)光底物（Luminata crescendo western HRP substrate）凝膠成像分析。

1.2.4 Tunel-FITC檢測細(xì)胞的凋亡率 收集對數(shù)期的HK-2細(xì)胞，調(diào)整懸液密度，每200μL營養(yǎng)液中含4 000個細(xì)胞，種植于96孔板上。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，各組分別加入順鉑16μmol／L誘導(dǎo)處理16 h，撤除藥物與hucMSC-Ex共培養(yǎng)8 h。按照FITCTunel試劑盒說明書進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。最后以DAPI避光染細(xì)胞核10 min，使用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測。

1.2.5 MTT法測定細(xì)胞增殖 實(shí)驗(yàn)前期處理同F(xiàn)ITC-Tunel法，每組設(shè)置5個重復(fù)孔。到達(dá)作用時間后，每孔加MTT溶液（5 mg／mL，用PBS配制，pH＝7.4）20μL。繼續(xù)避光孵育2 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加100μL DMSO，脫色搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物質(zhì)充分融解。選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔的光密度值，記錄結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HK-2細(xì)胞順鉑誘導(dǎo)前后的形態(tài)學(xué)變化

常規(guī)培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞形態(tài)為鵝卵石狀的上皮樣細(xì)胞，經(jīng)順鉑誘導(dǎo)16 h后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)由卵圓形變?yōu)樗笮位虿灰?guī)則形，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，并伴有較明顯的空泡形成。見圖1。

2.2 HucMSC-Ex降低了細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，hucMSC-Ex處理8 h后，順鉑誘導(dǎo)損傷的HK-2細(xì)胞Bax的表達(dá)下調(diào)（P＜0.001），而Bcl-2表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），在一定程度上減緩了順鉑所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。見圖2。

圖1 順鉑處理前后HK-2細(xì)胞形態(tài)變化（×100）

圖2 HucMSC-Ex處理后HK-2細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

此外，F(xiàn)ITC-Tunel檢測后通過高內(nèi)涵成像系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，和正常對照組相比，順鉑＋PBS組綠色熒光強(qiáng)度明顯增加（P＜0.001），而經(jīng)hucMSC-Ex處理8 h后，其綠色熒光強(qiáng)度顯著下降（P＜0.01）。見圖3、圖4。結(jié)果說明husMSC-Ex可明顯提高HK-2細(xì)胞的凋亡率。

圖3 Tunel-FITC檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

圖4 HucM SC-Ex處理后HK-2細(xì)胞的凋亡率

2.3 hucMSC-Ex處理后HK-2細(xì)胞增殖結(jié)果

熒光酶標(biāo)儀檢測發(fā)現(xiàn)，順鉑處理后，HK-2細(xì)胞增殖能力下降（P＜0.01）。而經(jīng)hucMSC-Ex處理8 h后，細(xì)胞增殖能力則明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。見圖5。

圖5 HucM SC-Ex處理后HK-2細(xì)胞的增殖能力

3 討論

順鉑的抗癌效果因不良反應(yīng)而受限，有1／3患者表現(xiàn)為腎毒性或急性腎損傷。本研究觀察hucMSCEx對順鉑誘導(dǎo)的人源腎上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)作用。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定以16μmol／L順鉑處理HK-2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)由橢圓形變?yōu)樗笮危坏蛲龅鞍譈ax的表達(dá)呈上調(diào)狀態(tài)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)和細(xì)胞增殖能力均下降。加入hucMSC-Ex后，HK-2細(xì)胞增殖能力和凋亡率發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，相對于損傷對照組，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡顯著減弱。

外切體是由細(xì)胞分泌的并帶有細(xì)胞表面抗原的囊性小泡［1］，小泡中包含大量的蛋白質(zhì)、脂類和RNA等生物活性物質(zhì)［5］，能與靶細(xì)胞特異性融合并將其包含的大量生物因子直接轉(zhuǎn)移入細(xì)胞內(nèi)部，更直接有效地作用于細(xì)胞，在細(xì)胞間信息傳遞方面發(fā)揮重要作用［1，9－10］。本研究的結(jié)果顯示，hucMSC-Ex通過抗凋亡和促增殖發(fā)揮了對順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的修復(fù)作用。然而，hucMSC-Ex中何種生物活性成分發(fā)揮作用，又是如何作用的確切機(jī)制還有待闡明。也有研究提示，外切體可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)miRNAs修復(fù)受損細(xì)胞［5］，這為我們進(jìn)一步的研究提供了思路與借鑒?？傊?，hucMSC來源的外切體可減緩順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果為臨床應(yīng)用hucMSC-Ex治療腎損傷提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells repair cisplatin induced human renal proximal tubular epithelial cells injury

JIANG Liu-liu，JIAHao-yuan，ZHU Yuan，YIN Lei，LILi-ming，YE Hui-hui，XUE Jian-guo，XUWen-rong，QIAN Hui
（School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the effects of exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells（hucMSCs-Ex）on cisplatin induced injury in human renal proximal tubular epithelial（HK-2）cells.M ethods：HK-2 cells injury were induced with cisplatin at a concentration of 16μmol／L for 16 h.Then injured HK-2 cellswere co-cultured with hucMSC-Ex for another 8 h.The apoptosis and proliferation of HK-2 cellswere tested byWestern blot，and FITC-Tunel assay and MTT respectively.At the same time，healthy HK-2 cells and injured HK-2 cells co-cultured with human lung fibroblasts-derived exosomes（HFL1-Ex）and PBSwere used as control.Results：Cisplatin-induced HK-2 injury was confirmed in vitro.Western blot results showed thatexpression of pro-apoptosis protein Bax was decreased and anti-apoptotic protein Bcl-2 was increased accordingly.FITC-Tunel results also showed HK-2 cells apoptosiswas reduced obviously in hucMSCs-Ex group.Furthermore，the MTT assay indicated that hucMSCs-Ex treatment promoted the proliferation of HK-2 cell.Conclusion：hucMSCs-Ex could alleviate cisplatin-induced HK-2 cell injury via promoting cell proliferation and inhibiting apoptosis.

exosomes；cisplatin；human renal proximal tubular epithelial（HK-2）cells；prolification；apoptosis

蔣留留（1987—），男，碩士研究生；錢暉（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，博士生導(dǎo)師，E-mail：lstmmmlst＠163.com

R692.6

A

1671－7783（2014）04－0294－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140088

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81272481，31340040）；江蘇省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目［蘇教科（2013）10號］；江蘇省醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才與創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（LJ201117）

2014－04－03 ［編輯］何承志