趙凱

（江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院消化科，江蘇金壇213200）

番茄紅素對(duì)小鼠肝纖維化的保護(hù)作用

趙凱

（江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院消化科，江蘇金壇213200）

目的：探討番茄紅素對(duì)刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的干預(yù)作用。方法：24只小鼠隨機(jī)均分為3組，對(duì)照組、模型組及預(yù)防組。模型組小鼠予以腹腔注射Con A（20 mg／kg），每周1次，對(duì)照組腹腔注射等量PBS溶液，預(yù)防組在注射Con A的同時(shí)予番茄紅素灌胃（20 mg／kg），每天1次，8周后處死小鼠。收集血液檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)，測(cè)定肝組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛水平，病理學(xué)及半定量計(jì)分系統(tǒng)（semi-quantitative scoring system，SSS）觀察肝纖維化程度，免疫印跡法檢測(cè)α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Smad3蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組血清透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前膠原（procollagen typeⅢ，PCⅢ）水平，SSS計(jì)分，丙二醛，α-SMA、TGF-β1、Smad3的表達(dá)明顯增加，SOD表達(dá)明顯降低；與模型組相比，預(yù)防組HA、LN、PCⅢ水平，SSS計(jì)分，丙二醛，α-SMA、TGF-β1、Smad3的表達(dá)明顯降低，SOD表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論：番茄紅素通過(guò)減輕過(guò)氧化損傷，保護(hù)肝細(xì)胞，減少膠原生成，抑制α-SMA、TGF-β1及Smad3等致纖維化因子的表達(dá)，從而抵抗Con A誘導(dǎo)的肝纖維化作用。

番茄紅素；肝纖維化；小鼠

脂質(zhì)過(guò)氧化損傷能破壞肝細(xì)胞，促使肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）增殖及活化，α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是重要的致肝纖維化細(xì)胞因子之一，TGF-β1／Smad3信號(hào)通路在肝纖維化形成過(guò)程中起著重要作用。番茄紅素是一種脂溶性不飽和碳?xì)浠衔?，?lèi)胡蘿卜素的一種，具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用。研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素具有對(duì)抗實(shí)驗(yàn)小鼠肝纖維化作用［1］。我們采用刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）腹腔注射昆明小鼠建立肝纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］，通過(guò)番茄紅素干預(yù)治療，檢測(cè)小鼠肝纖維化指標(biāo)、病理學(xué)改變、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛水平的變化及α-SMA、Smad3、TGF-β1的表達(dá)，探討番茄紅素抗小鼠肝纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠由江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2009-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2008-0024。

1.1.2 主要藥物及試劑 番茄紅素（純度99%）購(gòu)自上海英軒醫(yī)藥有限公司，批號(hào)20110411；Con A購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)L-7647；SOD、丙二醛試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，批號(hào)20110726；α-SMA購(gòu)自武漢博士德公司，批號(hào)BM002；Smad3兔多克隆抗體、TGF-β1兔多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為SC-8332、SC-146。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

24只小鼠隨機(jī)分3組，每組8只。模型組小鼠予以腹腔注射Con A，20 mg／kg，每周1次，對(duì)照組腹腔注射等量PBS溶液，預(yù)防組在注射Con A的同時(shí)予番茄紅素灌胃，20 mg／kg，每天1次。共8周。小鼠均摘除眼球取血，然后頸椎脫臼處死，取肝組織。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)

1.3.1 血清肝纖維化指標(biāo)檢測(cè) 采用放射免疫法檢測(cè)透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前膠原（procollagen typeⅢ，PCⅢ）含量。

1.3.2 肝組織病理學(xué)檢查 采用HE及Masson染色進(jìn)行病理學(xué)檢查，半定量計(jì)分系統(tǒng)（semi-quantitative scoring system，SSS）觀察肝纖維化程度。

1.3.3 SOD和丙二醛測(cè)定 稱(chēng)取0.2 g肝組織配成10%組織勻漿液，10 000 r／min離心10 min，取上清測(cè)定SOD和丙二醛含量。

1.3.4 免疫印跡法檢測(cè)α-SMA、TGF-β1、Smad3表達(dá) 取肝左葉同一部位組織，組織裂解液充分裂解，液態(tài)研磨，4℃，12 000 r／min離心10 min。SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉2 h，加入α-SMA、TGF-β1、Smad3和β-肌動(dòng)蛋白一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日TBST充分洗膜3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，洗去未結(jié)合的二抗，于暗室用ECL法檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，采用Quantity One圖像分析系統(tǒng)分析各條帶平均灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白灰度值的比值表示α-SMA、TGF-β1及Smad3的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 番茄紅素對(duì)肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)的影響

見(jiàn)表1，與對(duì)照組比較，模型組HA、LN、PCⅢ表達(dá)均明顯升高（P均＜0.01）；與模型組比較，預(yù)防組HA、LN、PCⅢ表達(dá)明顯降低（P均＜0.01）。

表1 各組肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)的比較n＝8，±s

表1 各組肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)的比較n＝8，±s

a：P＜0.01，與對(duì)照組比較；b：P＜0.01，與模型組比較

組別 HA（μg·L－1）LN（μg·L－1）PCⅢ（μg·L－1）對(duì)照組64.00±12.17 73.13±10.53 66.38±7.96模型組432.50±28.53a 133.13±10.38a 231.88±15.83a預(yù)防組121.88±23.03b 87.00±7.82b 90.00±6.32b F值631.54 84.58 543.08 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 小鼠肝臟組織病理變化

如圖1所示，對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)纖維增生；模型組多數(shù)肝小葉破壞、結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)擴(kuò)大，中央靜脈外周有纖維條索向外周延伸，部分區(qū)域出現(xiàn)纖維間隔；預(yù)防組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉內(nèi)見(jiàn)點(diǎn)灶狀壞死，少量纖維組織增生。

對(duì)照組、模型組和預(yù)防組SSS計(jì)分分別為（0.75±0.46）分、（7.38±1.19）分和（2.38±0.92）分，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝116.11，P＜ 0.01）；模型組SSS計(jì)分明顯高于對(duì)照組和預(yù)防組 （P＜0.01）。

圖1 各組小鼠肝組織病理結(jié)構(gòu)（×200）

2.3 番茄紅素對(duì)肝組織中SOD和丙二醛的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組SOD表達(dá)明顯降低、丙二醛表達(dá)明顯升高（P均＜0.01）；與模型組比較，預(yù)防組SOD表達(dá)明顯升高、丙二醛表達(dá)明顯降低（P均＜0.01）。

表2 各組小鼠肝組織SOD和丙二醛的比較n＝8，±s

表2 各組小鼠肝組織SOD和丙二醛的比較n＝8，±s

a：P＜0.01，與對(duì)照組比較；b：P＜0.01，與模型組比較

組別 SOD（U·mg－1） 丙二醛（nmol·mg－1）對(duì)照組113.88±8.53 1.16±0.23模型組 63.38±10.58a 3.39±0.31a預(yù)防組 103.38±13.00b 1.49±0.12b F值48.20 208.63 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.4 各組小鼠肝組織α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白的表達(dá)

α-SMA、TGF-β1及Smad3在模型組中呈高表達(dá)，而在對(duì)照組及預(yù)防組中呈低表達(dá)（α-SMA：F＝272.53；TGF-β1：F＝147.08；Smad3：F＝118.58，P均＜0.01）。與對(duì)照組比較，模型組α-SMA、TGF-β1及Smad3的表達(dá)明顯升高；與模型組比較，預(yù)防組α-SMA、TGF-β1及Smad3的表達(dá)明顯降低（P均＜0.01）。見(jiàn)圖2、圖3。

3 討論

圖2 免疫印跡法檢測(cè)α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白表達(dá)

圖3 各組小鼠肝組織α-SMA、TGF-β1及Smad3相對(duì)表達(dá)量

肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵是HSC的激活和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過(guò)度沉積。脂質(zhì)過(guò)氧化是肝臟炎癥損傷發(fā)展至肝纖維化的橋梁，自由基以及脂質(zhì)過(guò)氧化物直接刺激或通過(guò)旁分泌刺激HSC使其活化，誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生［3］。丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，反映自由基對(duì)肝細(xì)胞的損傷程度，SOD能清除超氧陰離子等自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷［4］。當(dāng)肝臟受到物理、化學(xué)及生物因素刺激時(shí)，HSC增殖并激活，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，通過(guò)旁分泌和自分泌合成大量的ECM，并表達(dá)α-SMA［5］。α-SMA是HSC活化及肌成纖維細(xì)胞激活的特征性標(biāo)志物［6］。近年來(lái)針對(duì)TGF-β1／Smad3研究藥物抗肝纖維化作用已成為纖維化防治的熱點(diǎn)［7－8］。作為最重要的致肝纖維化細(xì)胞因子之一，TGF-β1能夠抑制肝細(xì)胞的增殖，激發(fā)HSC的活化，促進(jìn)ECM的產(chǎn)生［9］。TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵因子Smad3是HSC活化的重要媒介，減少Smad3的激活是下調(diào)Ⅰ型膠原表達(dá)的關(guān)鍵步驟［10］，而Smad3缺失能夠?qū)垢闻K纖維化［11］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ConA腹腔注射昆明小鼠建立肝纖維化模型，結(jié)果顯示模型組HA、LN及PCⅢ明顯增高，肝組織病理學(xué)及SSS計(jì)分符合肝纖維化表現(xiàn)，說(shuō)明造模成功。預(yù)防組血清肝纖維化指標(biāo)下降，病理學(xué)改善明顯，進(jìn)一步證實(shí)番茄紅素具有抗肝纖維化作用。此外，通過(guò)番茄紅素干預(yù)可明顯增加SOD含量，降低丙二醛含量；小鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、Smad3的水平明顯降低，提示番茄紅素能減輕過(guò)氧化損傷，保護(hù)肝細(xì)胞，減少膠原生成，并能抑制重要的致纖維化因子α-SMA、TGF-β1及Smad3的表達(dá)，具有良好的抗纖維化作用。

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Protective effect of lycopene on hepatic fibrosis in m ice

ZHAO Kai
（Department of Gastroenterology，Jintan Hospital Affiliated to Jiangsu University，Jintan Jiangsu 213200，China）

Objective：To investigate protective effect of lycopene on liver fibrosis in mice induced by concanavalin A（Con A）.M ethods：Twenty-four mice were equally randomized into 3 groups：control group，model group and prevention group.Themice inmodel group was received intraperitoneal injection of CoA（20 mg／kg），one time per week，while control group received normal saline，prevention group was received intragastric administration of lycopene，one time per day，for 8 weeks.Mice blood were collected to test the indices of hepatic fibrosis.Grade of hepatic fibrosiswere evaluated according to the semi-quantitative scoring system（SSS）.Western blotting was used to test the expression ofα-smooth muscle actin（α-SMA），Smad3 protein（Smad3）and transforming growth factor-β1（TGF-β1）.Results：Compared with the control group，themodel group showed higher serum levels of hyaluronic acid（HA），laminin（LN），procollagen typeⅢ（PCⅢ），SSSscore，malonaldehyde level，the expression ofα-SMA，TGF-β1and Smad3，lower superoxide dismutase（SOD）（both P＜0.01）；compared with the model group，the prevention group showed lower serum levels of HA，LN，PCⅢ，SSS score，malonaldehyde level，the expression ofα-SMA，TGF-β1and Smad3，higher levels of SOD（both P＜0.01）.Conclusion：Lycopene could sharply decrease the harm of peroxidation，protect the liver cells，reduce the collagen production and restrain the expression of the important factor ofα-SMA，Smad3，TGF-β1which lead to liver fibrosis，so that lycopene had the notable alleviate effect on liver fibrosis induced by ConA.

lycopene；hepatic fibrosis；mice

趙凱（1974—），男，江蘇金壇人，副主任醫(yī)師，主要從事肝臟疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。

R575.2

A

1671－7783（2014）04－0290－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140157

金壇市科技局計(jì)劃項(xiàng)目（TS2010073）

2014－05－01 ［編輯］劉星星