張杰，賈麗娟，梁冰，步雪峰

（1.江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江212002；2.江蘇大學臨床醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212001）

應(yīng)用福愛樂醫(yī)用膠粘貼法構(gòu)建人胃癌組織塊原位移植模型

張杰1，2，賈麗娟2，梁冰2，步雪峰1

（1.江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江212002；2.江蘇大學臨床醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：利用福愛樂醫(yī)用膠構(gòu)建人胃癌組織塊裸鼠原位移植模型，為研究胃癌的病理生理過程及實驗研究提供理想的動物模型。方法：以人胃癌SGC-7901細胞株反復(fù)接種傳代于BALB／C裸鼠皮下形成的皮下移植瘤組織塊為材料，利用福愛樂醫(yī)用膠將其粘貼在30只裸鼠胃大彎側(cè)漿膜下，分別在術(shù)后4、6、8周隨機取10只裸鼠觀察原位移植瘤的生長狀況、移植成功率及轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果：原位移植瘤成瘤率為100%。隨著飼養(yǎng)時間的延長，胃癌腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟黏連等出現(xiàn)率逐漸增高。結(jié)論：利用福愛樂醫(yī)用膠粘貼法能夠安全、便捷地建立人胃癌裸鼠原位移植瘤模型，并可模擬胃癌的臨床發(fā)生發(fā)展過程。

胃癌；原位移植模型；醫(yī)用膠

胃癌的浸潤與轉(zhuǎn)移是影響患者治療和預(yù)后的重要因素，因此建立一種能體現(xiàn)人體胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移方式的理想動物模型是研究胃癌發(fā)病機制及治療方法的重要前提［1］。20世紀90年代初期Furukawa等［2］將完整組織塊原位縫掛于裸鼠漿膜損傷的胃壁（縫掛法）建立的人胃癌移植模型較Yamaguchi等［3］將胃癌AZL5G細胞株制成單細胞懸液接種于裸鼠胃壁內(nèi)建立的人胃癌移植模型成瘤率高。到20世紀90年代末期，汪芳裕等［4］又采用裸鼠胃壁縫制黏膜小囊包埋腫瘤組織塊（胃囊法）制成胃癌移植模型。近年來，利用OB生物醫(yī)用膠構(gòu)建的裸鼠胃癌原位模型得到了普遍的應(yīng)用［5］。這種方法的主要優(yōu)勢在于裸鼠創(chuàng)傷小、成瘤率高、成瘤周期短，不易引起裸鼠消化道梗阻等。福愛樂（FAL）醫(yī)用膠在普通醫(yī)用膠的基礎(chǔ)上提高了單體純度，優(yōu)化了普通醫(yī)用膠的綜合性能，使醫(yī)用膠在許多科室成為必用品，并發(fā)展成為醫(yī)用膠治療學［6］。本實驗中，我們采用FAL醫(yī)用膠構(gòu)建人胃癌組織塊裸鼠原位移植模型，成瘤率達到100%，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

4周齡BALB／C雄性裸鼠40只，體質(zhì)量14～16 g，購于揚州大學醫(yī)學比較中心，動物合格證號為［SCXK（蘇）2012－0004］，SPF級條件下飼養(yǎng)。傳代于裸鼠皮下的人胃癌SGC-7901細胞系由本實驗室凍存?zhèn)鞔?。FAL醫(yī)用膠購于北京福愛樂醫(yī)用膠研究所，批號20110306。胎牛血清（FBS）和無血清培養(yǎng)液DMEM為美國Gibco公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠皮下瘤的種植和傳代 10只裸鼠用作皮下瘤傳代。收集體外培養(yǎng)的SGC-7901細胞，制成5×107／mL的細胞懸液，用1 mL無菌注射器在2只裸鼠右側(cè)腋下皮下注射0.2mL的細胞懸液，形成皮丘。約30 d皮下瘤長徑達1 cm，此時在無菌條件下取出皮下瘤，去除外周皮下組織、結(jié)締組織，PBS洗滌后用眼科剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm。將這些瘤組織塊在另2只裸鼠腋下皮下移植，如此反復(fù)成瘤移植4代。

1.2.2 原位移植瘤模型的建立 30只裸鼠用作胃癌原位移植瘤模型的構(gòu)建。待上述形成第4代皮下移植瘤的裸鼠皮下瘤直徑達1 cm時用于原位移植。移植前1天原位移植裸鼠禁食。無菌操作下取出第4代皮下瘤，剪成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，浸潤在PBS中待用。待移植的裸鼠用氯胺酮70 mg／kg腹腔注射麻醉，取仰臥位，固定四肢，鋪無菌洞巾，腹部皮膚以碘附消毒，腹部左正中切口進腹。無菌棉球填塞胃后方，顯露胃大彎，用無菌1 mL注射器針頭在胃大彎側(cè)挑破胃漿膜，將粘有FAL醫(yī)用膠的皮下瘤組織塊貼在胃漿膜挑破處，約5 s后組織塊即可與胃漿膜粘貼，檢查確認組織塊粘貼處無出血，然后將胃還納入腹腔，取出填塞的棉球，6－0縫合線關(guān)腹（腹膜，肌層，皮膚）。腹部切口再次以碘附消毒，涂抹金霉素眼膏防止感染。

1.2.3 胃癌原位移植瘤成瘤率、移植瘤轉(zhuǎn)移和浸潤情況 原位移植術(shù)后繼續(xù)在SPF級條件下飼養(yǎng)，定時觀察裸鼠的運動、飲食情況和腹部體征。分別在原位移植術(shù)后4、6、8周對小鼠進行B超檢查。然后隨機處死10只裸鼠，開腹探查移植瘤位置、大小、有無與周圍器官黏連、轉(zhuǎn)移情況、有無腹腔積液。取出原位瘤、肝臟、腫大淋巴結(jié)，采用10%甲醛固定保存，石蠟包埋，制切片行HE染色，倒置顯微鏡下觀察病理組織學結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 原位移植瘤裸鼠生長情況

移植術(shù)后4周裸鼠左上腹可觸及直徑約6 mm的硬質(zhì)腫塊，超聲影像顯示胃大彎處橢圓形低回聲光團，邊緣規(guī)整，內(nèi)部回聲尚均勻。術(shù)后6周裸鼠左上腹可觸及直徑約10 mm的硬質(zhì)腫塊，超聲影像基本與術(shù)后4周相似，只是低回聲光團增大，內(nèi)部回聲欠均勻。術(shù)后8周時裸鼠左上腹可觸及直徑約17 mm的硬質(zhì)腫塊，肉眼即可在裸鼠左側(cè)腹部看見腫塊，B超顯示低回聲光團比6周時增大，形態(tài)不規(guī)則，邊緣不規(guī)整，可見部分囊性壞死。隨著時間的延長，裸鼠活動能力呈進行性下降，飲食亦逐漸減少。術(shù)后4、6、8周裸鼠腹部超聲影像見圖1。

圖1 原位移植瘤術(shù)后不同時間裸鼠腹部B超檢查結(jié)果

2.2 大體病理

肉眼可見胃底胃大彎側(cè)灰白色腫瘤組織，觸及質(zhì)地較硬，腫塊表面呈不規(guī)則結(jié)節(jié)樣。30個原位移植瘤成瘤率為100%。在3個不同時間點觀察到原位移植瘤大體病理切面均呈灰白色魚肉樣。瘤體直徑4周時平均為（6±0.53）mm，6周時為（10± 1.35）mm，8周達（17±2.06）mm。裸鼠在8周時出現(xiàn)腹腔積液。隨著術(shù)后時間的延長，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移逐漸增多，移植瘤模型表現(xiàn)與臨床胃癌的病理生理行為極為相似。

2.3 組織病理

光鏡下胃癌原位移植瘤組織內(nèi)見到大量排列紊亂呈類圓形、核胞比增大、核大深染、多呈分裂象的細胞替代正常腺體組織。肝臟內(nèi)未見轉(zhuǎn)移癌細胞。腹腔內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶見腫瘤細胞浸潤性生長，與原位移植瘤在組織形態(tài)學上相似。見圖2。

圖2 原位移植瘤、肝臟、腹腔轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)病理組織（HE染色）

3 討論

建立人胃癌組織塊原位移植瘤模型的目的是能夠最大限度地模擬胃癌的病理生理過程。理想的胃腫瘤動物模型應(yīng)具備以下條件：①致癌方法簡單易行；②經(jīng)濟快速；③指標客觀明確；④對癌變器官的特異性高；⑤重復(fù)性好；⑥誘發(fā)腫瘤的病理類型、生物學行為、電鏡下表現(xiàn)及組織化學改變應(yīng)與人體腫瘤相似［7］。

長期的研究發(fā)現(xiàn)，與癌細胞懸液原位移植模型比較，胃癌組織塊原位移植模型具有更高的移植成功率及轉(zhuǎn)移率［8］。癌細胞懸液原位移植成瘤率和轉(zhuǎn)移率較低，可能是因為經(jīng)胰酶消化處理后，腫瘤細胞的生長與轉(zhuǎn)移受到一定影響。腫瘤組織塊原位移植具有原位移植和保持癌組織的完整結(jié)構(gòu)的優(yōu)點，所以原位移植成功率、轉(zhuǎn)移率、荷瘤鼠中位生存期等指標都較高。近些年普遍使用OB膠粘貼法構(gòu)建原位移植瘤，操作簡單，術(shù)中出血少，術(shù)后恢復(fù)快，明顯提高了裸鼠存活率，并且保持了癌組織的完整結(jié)構(gòu)，避免了細胞表面結(jié)構(gòu)遭到破壞而導(dǎo)致惡性腫瘤生物學行為和自然屬性、惡性程度的改變，更好地模擬了臨床腫瘤發(fā)生過程［9］。但是OB膠不易被組織吸收，在腫瘤模型中可能影響腫瘤組織的外生性生長，在原位移植瘤的生長過程中容易使腫瘤中心大量壞死［10］。

本次實驗中人胃癌原位移植瘤模型的構(gòu)建依舊采用粘貼法，但應(yīng)用的是FAL醫(yī)用膠。FAL醫(yī)用膠是一種人工合成、無色透明的α-氰基丙烯酸正辛酯（NOCA）和α-氰基丙烯酸正丁酯（NBCA）組成的生物醫(yī)學工程材料，兩種單體的純度均在99%以上，聚合熱低，體外聚合速度適當，連接強度大，在陰離子（體液、血液）作用下，擴散性好，3～5 s即可固化成與人體組織韌性相近的薄膜。該膠噴涂在體內(nèi)臟器表面后2～4周即可降解吸收并排出體外。多種動物實驗、多器官試驗顯示無致畸、致癌、促癌、染色體畸變等損害［11］。原位瘤組織大體切面見魚肉樣灰白，未見壞死，組織HE染色未見壞死，這一點明顯優(yōu)于OB膠。臨床上胃癌淋巴轉(zhuǎn)移為主要轉(zhuǎn)移途徑，早期可出現(xiàn)，血行轉(zhuǎn)移出現(xiàn)于晚期。本次實驗中移植瘤模型裸鼠腹腔內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率術(shù)后6周時為40%，8周為70%，未見肝臟轉(zhuǎn)移，符合胃癌的臨床特點。

為了方便而有效地研究胃癌的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，使用裸鼠動物模型是一個極為重要和有效的實驗手段，胃癌模型構(gòu)建方法的不斷改進，將為胃癌的研究提供更好的手段。

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Application of FAL medical glue in establishing the human gastric cancer tissuemass orthotopic transplantation model

ZHANG Jie1，2，JIA Li-juan2，LIANG Bing2，BU Xue-feng1
（Department of General Surgery，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002；2.School of Clinical Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To establish nudemouse orthotopic transplantationmodel of human gastric cancer tissuemass by FALmedical glue for the study of pathophysiological process of gastric cancer and experimental study to provide an ideal animalmodel.M ethods：Transplanted gastric cancer tissuemasswas constructed through repeatedly subcutaneously inoculating and passaging human gastric cancer cell line SGC-7901 in BALB／C nudemouse，and pasted orthotopically on the greater curvature by FALmedical glue.The orthotopic transplantation tumor growth characteristics，and success rate of transplantion andmetastasis ratewere examined.Results：Orthotopic transplantation tumor ratewas 100%by thisway.As the extension of feeding time，lymph nodemetastasis，liver adhesion rate increased gradually.Conclusion：Using FALmedical glue can safely and conveniently establish human gastric cancer nudemouse orthotopic transplantation tumor model，and simulated gastric cancer clinical development asmuch as possible.

gastric cancer；orthotopic transplantation model；medical glue

R541.75

A

1671－7783（2014）04－0287－03

10.13312／j.issn.1671-7783.y140023

鎮(zhèn)江市社會發(fā)展基金資助項目（JLY2010005）；江蘇大學臨床醫(yī)學科技發(fā)展基金資助項目（JLY2010005）

張杰（1987—），男，碩士研究生；步雪峰（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：xuefengbu05＠163.com

2014－02－10 ［編輯］陳海林