劉超，鄭金旭，許姣，朱勤，杜傳沖

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

IL-33／TLR4信號(hào)通路在A549細(xì)胞上皮 間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

劉超，鄭金旭，許姣，朱勤，杜傳沖

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：探討IL-33／TLR4信號(hào)通路在上皮來源的A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。方法：培養(yǎng)A549細(xì)胞，用5 ng／mL的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）刺激A549細(xì)胞；在不同時(shí)間點(diǎn)（0，12，24，48 h）MTT法檢測(cè)TGF-β1對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響；熒光定量PCR方法檢測(cè)IL-33信號(hào)通路中關(guān)鍵因子IL-33，Toll樣受體4（TLR4）基因的表達(dá)改變；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、E鈣黏蛋白（E-cad）、磷酸化蛋白激酶（p-AKT）的動(dòng)態(tài)表達(dá)。結(jié)果：TGF-β1刺激A549細(xì)胞后，細(xì)胞增殖無明顯變化（P＞0.05），IL-33表達(dá)量先升高，后下降（P＜0.05）；E-鈣黏蛋白表達(dá)量逐漸下降，α-SMA表達(dá)量逐漸升高，TLR4先升高后下降（P＜0.05）；p-AKT表達(dá)量逐漸升高（P＜0.05）。結(jié)論：IL-33／TLR4信號(hào)通路在A549細(xì)胞的上皮 間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用。

白細(xì)胞介素-33；上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；Toll樣受體4

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是彌漫性間質(zhì)性肺疾病的常見類型，病因未明，呈慢性、進(jìn)行性進(jìn)展，發(fā)病率、致死率均較高，是特發(fā)性間質(zhì)性肺疾病中最常見、最嚴(yán)重的一種疾病，平均生存期2～5年，死亡率超過大多數(shù)腫瘤，尚無特效藥物治療［1］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肺纖維化發(fā)病的一種重要機(jī)制，肺泡上皮細(xì)胞受各種致病因素的刺激，獲得間質(zhì)細(xì)胞的表型，是成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞的重要來源［2］。前期研究已初步證明IL-33／ST2通路在肺纖維化疾病中異常激活［3－4］，作為與ST2受體同一超家族的Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4），與ST2有著極其相似的結(jié)構(gòu)，是否也在肺纖維化的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用？本實(shí)驗(yàn)旨在通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）誘導(dǎo)Ⅱ型肺泡上皮來源的A549細(xì)胞EMT過程，制備細(xì)胞層面的肺纖維化模型，探討IL-33／TLR4信號(hào)通路與肺纖維化之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

TGF-β1（Perotech公司）；DMSO（Calbiochem公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Wisent公司）；PCR試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）；兔抗人E鈣黏蛋白（E-cad）抗體、小鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（均購(gòu)自武漢博士德公司）；兔抗人磷酸化蛋白激酶（p-AKT）抗體（CST公司）；兔抗人GAPDH抗體（Santa公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、兔抗小鼠IgG（Santa公司）；A549細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)A549細(xì)胞，將其接種于培養(yǎng)瓶中，放置在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將A549細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%～80%時(shí)，用無血清培養(yǎng)基饑餓12 h，換新鮮培養(yǎng)基，隨機(jī)分組，于細(xì)胞培養(yǎng)液中加入TGF-β1，濃度為5 ng／mL［5］。

1.2.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 將培養(yǎng)的A549細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，調(diào)整為2×104／mL的單細(xì)胞懸液后，傳代到96孔板，每孔200μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)調(diào)零孔。加入終濃度為5 ng／mL的TGF-β1處理12，24，48 h，每組取出一塊培養(yǎng)板，每孔加入5 mg／mLMTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加入150μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。以630 nm波長(zhǎng)為參考，在酶標(biāo)儀上490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)過程3次。

1.2.4 PCR檢測(cè)TLR4、IL-33基因的表達(dá) 用5 ng／mL的TGF-β1刺激細(xì)胞，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)（0，12，24，48 h）細(xì)胞TLR4、IL-33 mRNA相對(duì)表達(dá)量。將細(xì)胞密度為1×105／mL的單細(xì)胞懸液接種到6孔板中，每孔加1 mL Trizol，按照其說明書提取細(xì)胞總RNA。取收集的RNA用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。所用引物由上海捷瑞工程有限公司合成。引物序列如下，TLR4上游：5′-AGACCTGTCCCT GAACCCTATGAAC-3′，下游：5′-CTAAACCAGCCAGA CCTTGAATACA-3′；IL-33上游：5′-ATGCCAACAACA AGGAACACTCTG-3′，下游：5′-ATAAACACTCCAGGA TCAGTCTTGC-3′；β-肌動(dòng)蛋白上游：5′-CCAGGCGTT ATGGTAGGCA-3′，下游：5′-TTCCATATCGTCCCAGTT GGT-3′。

TLR4擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃變性。58℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。IL-33擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃變性5 s，58℃退火20 s，72℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果用2－ΔΔCT法分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定E-cad、α-SMA、p-AKT的蛋白表達(dá) 用5 ng／mL的TGF-β1刺激細(xì)胞，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)（0，12，24，48 h）細(xì)胞蛋白表達(dá)量的變化。將1×105／mL密度的單細(xì)胞懸液接種到6孔板中，每孔2 mL，加入TGF-β1后分別培養(yǎng)0，12，24，48 h，PBS沖洗3次后分別加入100μL含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的細(xì)胞裂解液，放置冰上，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后收集到EP管中，5 min振蕩1次，每次1 min，共4次，使細(xì)胞充分裂解；12 000 r／min離心15 min后吸取上清加入新的EP管中，4∶1加入5×上樣緩沖液煮沸5 min，冷卻至室溫后，置于－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。蛋白上樣后恒壓電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，時(shí)間為90 min，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，孵一抗（1∶1 000）過夜。TBST洗膜3次后，敷HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）30 min，再以TBST洗膜3次，于Typhoon掃描儀中成像并記錄，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

A549細(xì)胞在高糖DMEM培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)，且細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。加5 ng／mL的TGF-β1培養(yǎng)12，24，48 h后，細(xì)胞增殖率分別為0.033 767，0.029 733，0.031 333，各時(shí)間點(diǎn)比較差無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0.252，P＞0.05）。

2.2 TGF-β1對(duì)A549細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白的影響

見圖1、表1。隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比較，12，24，48 h的E-鈣黏蛋白表達(dá)量逐漸下降（F＝29.332，P＜0.05）；與對(duì)照組比較，12，24，48 h的α-SMA表達(dá)量逐漸升高（F＝22.279，P＜0.05）。

圖1 TGF-β1對(duì)A549細(xì)胞E-鈣黏蛋白和α-SMA蛋白表達(dá)的影響

表1 TGF-β刺激后A549細(xì)胞E-鈣黏蛋白1和α-SMA相對(duì)表達(dá)

2.3 TGF-β1刺激后A549細(xì)胞IL-33基因的表達(dá)

TGF-β1刺激A549細(xì)胞后IL-33基因呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)（F＝37.412，P＜0.05）。12、24 h的IL-33基因表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，48 h表達(dá)量下降但仍然高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 TGF-β1刺激后A549細(xì)胞IL-33基因表達(dá)的變化

2.4 TGF-β1刺激后A549細(xì)胞TLR4基因的表達(dá)

TGF-β1刺激A549細(xì)胞后，TLR4呈先升高后下降趨勢(shì)（F＝31.239，P＜0.05）。與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。12、24 h的TLR4基因的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），在24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，48 h表達(dá)量下降但仍高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 TGF-β1刺激后A549細(xì)胞TLR4基因表達(dá)的變化

2.5 TGF-β1刺激后A549細(xì)胞p-AKT蛋白的表達(dá)

TGF-β1刺激A549細(xì)胞后，0，12，24，48 h時(shí)p-AKT蛋白相對(duì)灰度值為0.073±0.037，0.149± 0.136，0.423±0.119，0.683±0.361，p-AKT蛋白表達(dá)水平呈逐漸升高的趨勢(shì)（F＝30.737，P＜0.05）。12，24，48 h時(shí)p-AKT蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，見圖4。

圖4 TGF-β1刺激后A549細(xì)胞p-AKT蛋白的表達(dá)

3 討論

肌成纖維細(xì)胞是IPF的重要效應(yīng)細(xì)胞［6］，而上皮細(xì)胞的EMT過程是肌成纖維細(xì)胞的一個(gè)重要來源［7］。A549細(xì)胞為肺腺癌細(xì)胞，屬上皮來源細(xì)胞，具備穩(wěn)定的肺泡上皮細(xì)胞的特征，常被用作肺泡II型細(xì)胞的代表實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1刺激A549細(xì)胞后，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏表達(dá)量逐漸下降，而間充質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，提示TGF-β1可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT，與本課題組前期研究結(jié)果一致［8］。進(jìn)一步提示，EMT在IPF的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，但EMT的具體機(jī)制仍未明確。

Schmitz等［9］在2005年通過測(cè)量工具發(fā)現(xiàn)IL-33同IL-1和成纖維生長(zhǎng)因子具有相同的β三葉草結(jié)構(gòu)，其基因序列、結(jié)構(gòu)與IL-1和IL-18相似，屬于IL-1超家族，在上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)較高，當(dāng)上述細(xì)胞因各種因素受損傷時(shí)，IL-33可被動(dòng)地釋放出來，引起其他細(xì)胞的遷移、分化、成熟等生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，IL-33在TGF-β1刺激A549細(xì)胞12 h后開始增多，24 h達(dá)到最高峰，提示在TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的早期，存在IL-33的高表達(dá)。我們推測(cè)，TGF-β1所致的A549細(xì)胞損傷釋放了損傷相關(guān)分子IL-33。IL-33前體為31 000的蛋白，成熟的IL-33是經(jīng)Caspase-1剪切后產(chǎn)生，分泌出細(xì)胞后，作為細(xì)胞因子通過IL-1受體家族發(fā)揮生物學(xué)作用［10］，如ST2等。TLR4也是IL-1受體家族成員之一，與ST2有相似的STI結(jié)構(gòu)，故推測(cè)IL-33能夠與TLR4結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。Kurowska-Stolarska等［10］于2009年曾報(bào)道過IL-33刺激人巨噬細(xì)胞后，TLR2、TLR4表達(dá)升高，Liu等［11］也報(bào)道了在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中TLR2、TLR4的表達(dá)升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)TGF-β1處理過的A549細(xì)胞，TLR4 mRNA表達(dá)量升高，且趨勢(shì)與IL-33的升高趨勢(shì)相同，推斷IL-33可通過TLR4發(fā)揮生物學(xué)作用。

激活的TLR4能夠活化下游分子髓樣分化因子88（MyD88），活化的MyD88能夠募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）等，激活經(jīng)典的TLR4／MyD88信號(hào)通路，啟動(dòng)NF-κB通路和MAPK通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為［12］。

Lombardo等［13］發(fā)現(xiàn)，TLR4還能夠激活PI3K。PI3K激活后，其催化產(chǎn)物與AKT分子中PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使AKT磷酸化，PI3K／AKT通路被激活。p-AKT是AKT的活化形式，可間接反應(yīng)PI3K的活性［14］。PI3K／AKT信號(hào)通路主要作用是抗凋亡。AKT還能通過對(duì)NF-κB和p53的間接作用影響細(xì)胞存活［14］。AKT通過磷酸化活化為p-AKT，然后激活kB激酶（IKK）導(dǎo)致NF-κB的抑制劑IκB的降解，從而使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)中釋放出來進(jìn)行核轉(zhuǎn)位，激活其靶基因而促進(jìn)細(xì)胞的存活。本實(shí)驗(yàn)中，p-AKT表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多，證明PI3K／AKT信號(hào)通路被激活。

綜上所述，TGF-β1刺激后A549細(xì)胞出現(xiàn)損傷，而在損傷早期IL-33可能作為警報(bào)素從細(xì)胞中釋放出來，啟動(dòng)一系列的抗損傷和抗凋亡反應(yīng)。ST2和TLR4都可作為IL-33的受體，呈競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。活化后的TLR4激活MyD88，逐漸激活下游分子，呈級(jí)連反應(yīng)，最終導(dǎo)致纖維化的形成。然而，細(xì)胞信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)以TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞的EMT，揭示了IL-33在EMT過程發(fā)揮了作用，為IPF的發(fā)病機(jī)制的闡述及治療提供了部分新的思路。

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Effect of IL-33／TLR4 signal pathway in inducing A549 cells transition to mesenchymal cells from epithelium in vitro

LIU Chao，ZHENG Jin-xu，XU Jiao，ZHU Qin，DU Chuan-chong
（Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To investigate the role andmechanism of IL-33 in the process of turning epithelium-mesenchyme for A549 cellswhich is in one strain of human alveolar epithelial cells.M ethods：To stimulate cultured A549 cellswith TGF-β1（5 ng／mL）.MTT assay was used to assess the proliferation of the A549 cells in response to TGF-β1treatment the dynamic expressions of IL-33／TLR4 mRNA were detected by RT-PCR.Western blotting were employed to examine the mRNA and protein expressions ofα-smooth muscle actin（α-SMA）and E-cad，p-AKT.Results：The data showed that TGF-β1had no obvious effects on the proliferation of A549 cells.Stimulated by TGF-β1，E-cad expression of A549 cells gradually declined.α-SMA expression was higher.p-AKT expression gradually increased.Real-time PCR had shown that expressions of IL-33／TLR4 mRNA increased firstly then decreased gradually.The significant differenceswere observed from 0 h to 24 h，especially on 24 h，compared with control group（P＜0.05）.Conclusion：IL-33／TLR4／PI3K／AKT signal transduction pathway promoted epithelial-mesenchymal transition（EMT）of A549，especially on earlier inflammatory reaction.

IL-33；epithelial-mesenchymal transition；Toll like receptor

R332；R563

A

1671－7783（2014）04－0283－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140076

衛(wèi)生部科研項(xiàng)目（WKJ2006－2－026）；上海市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（10ZR1422600）

劉超（1987—），男，碩士研究生；鄭金旭（通訊作者），教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail：jxzh135＠163.com

2014－03－24 ［編輯］何承志