烏蘭其其格 麻春杰 呼日樂(lè)巴根 海英 布和朝魯 白龍 邸彥清

額爾敦—烏日勒對(duì)兔動(dòng)脈粥樣化易損斑塊模型血清超敏C反應(yīng)蛋白及相關(guān)炎癥因子的影響

烏蘭其其格 麻春杰 呼日樂(lè)巴根 海英 布和朝魯 白龍 邸彥清

目的觀察額爾敦—烏日勒對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型血清超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein -1，MCP-1)、細(xì)胞間粘附因子(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)、血管粘附因子(vascular adhesion molecule-1，VCAM-1)的影響，以探討額爾敦—烏日勒改善動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊病變的可能機(jī)制。方法50只雄性新西蘭大耳白兔隨機(jī)分為4組，分別為正常組、模型組、額爾敦—烏日勒組及辛伐他汀組。通過(guò)高脂飼料、免疫損傷結(jié)合經(jīng)股動(dòng)脈球囊拉傷建立家兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，實(shí)驗(yàn)第8周開始給藥至24周，取血檢測(cè)炎癥因子hs-CRP、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1；取主動(dòng)脈，光鏡觀察組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果額爾敦—烏日勒組主動(dòng)脈病變程度相對(duì)較輕，纖維帽厚度與內(nèi)中膜厚度比值高于模型組(P<0.01)，同時(shí)能明顯降低動(dòng)脈粥樣硬化家兔血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1含量(P<0.01)。結(jié)論額爾敦—烏日勒可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，降低hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1上升水平來(lái)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的形成、發(fā)展和穩(wěn)定易損斑塊的作用。

額爾敦—烏日勒； 動(dòng)脈粥樣硬化； 高敏C反應(yīng)蛋白； 炎性因子； 兔

目前大量的研究證據(jù)表明動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種慢性血管炎癥疾病[1-3]。炎癥反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展和破裂的全過(guò)程。炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起了極其重要的作用。前期研究表明傳統(tǒng)蒙藥額爾敦—烏日勒具有消退早期動(dòng)脈粥樣硬化的作用[4]。本研究主要觀察額爾敦—烏日勒對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊病理、血清炎癥因子高敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、細(xì)胞間粘附因子(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)、血管粘附因子(vascular adhesion molecule-1，VCAM-1)的影響，并探討額爾敦—烏日勒改善動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊病變的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只健康雄性新西蘭大耳白兔，體重(2.0±0.2)kg，由北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠提供，許可證編號(hào)：SCXK(京)2011-0006，分籠飼養(yǎng)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥研究院動(dòng)物中心完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

額爾敦—烏日勒，批號(hào)：121164，2 g /10粒，30粒/瓶，內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司生產(chǎn)。辛伐他汀片，批號(hào)：121002，20 mg/片，12片/盒，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司生產(chǎn)。戊巴比妥鈉，批號(hào)：F20030816，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司。牛血清白蛋白(Albumin, bovine, fraction V)CAS Number：9048-46-8，內(nèi)蒙古呼和浩特市澤生試劑公司。肝素鈉注射液，批號(hào)：20110313，1.25萬(wàn)U/2 ml，天津生物化學(xué)制藥有限公司生產(chǎn)。青霉素鈉，批號(hào)：Y1207622，160萬(wàn)U/瓶，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要試劑與儀器

hs-CRP試劑盒，貨號(hào)：CSB-E06847Rb，MCP-1試劑盒，貨號(hào)：CSB-E06921Rb，ICAM-1試劑盒，貨號(hào)：CSB-E06974Rb，VCAM-1試劑盒，貨號(hào)：CSB-E10092Rb，武漢華美生物工程有限公司；ST16R高速離心機(jī)，美國(guó)熱電公司 ；MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀，美國(guó)熱電公司；日本OLYMPUS-BX51生物顯微鏡(奧林巴斯)；HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)；DH4000A電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及模型制備 50只新西蘭大耳白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只及造模組40只。正常對(duì)照組，每只喂飼普通飼料150 g/天，造模組喂飼由86%普通飼料+1%膽固醇+8%蛋黃粉+5%豬油配置的高脂飼料100 g/只/日(早)，普通飼料50 g/只/日(晚)直至24周取材。第2周造模組經(jīng)兔耳緣靜脈一次性注射牛血清白蛋白500 mg/只，第4周用球囊拉傷術(shù)損傷動(dòng)脈[5]。所有實(shí)驗(yàn)兔均單籠飼養(yǎng)，自由飲水。第8周末，將所有實(shí)驗(yàn)兔禁食12小時(shí)以上，經(jīng)耳緣靜脈抽取空腹血檢測(cè)血清總膽固醇(total cholestrol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)及低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平，結(jié)果顯示造模組血脂水平均顯著升高，隨機(jī)選取4只造模組兔處死后，剝離主動(dòng)脈全長(zhǎng)，剖開血管壁均可見明顯隆起斑塊，表明兔AS模型建立成功。將造模組兔子隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組(簡(jiǎn)稱辛伐組)、額爾敦—烏日勒組(簡(jiǎn)稱額爾敦組)。

1.4.2 給藥方法 將辛伐他汀片和額爾敦—烏日勒研磨、分別用蒸餾水制備混懸液，用灌服給藥。參照動(dòng)物與人體體重等效劑量折算系數(shù)，依據(jù)每只實(shí)驗(yàn)兔的體重，計(jì)算出相應(yīng)的給藥劑量。每天1次，連續(xù)給藥16周。每2周稱量體重一次，據(jù)此調(diào)整給藥劑量。其中辛伐他汀為陽(yáng)性對(duì)照藥，模型組用等容積的蒸餾水灌胃。

1.4.3 主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)檢查 第24周實(shí)驗(yàn)結(jié)束取血后處死動(dòng)物，取主動(dòng)脈弓段約1 cm放入10%中性甲醛溶液中固定、梯度酒精脫水、透明、石蠟包埋，切片，切片厚度5 μm作HE染色，光鏡下觀察受損血管組織形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)采用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量主動(dòng)脈壁纖維帽厚度(fiber cap thickness，F(xiàn)CT)、內(nèi)中膜厚度(intima-media thickness，IMT)，并計(jì)算纖維帽厚度與內(nèi)中膜厚度比值(FCT/IMT)。

1.4.4 血清指標(biāo)檢測(cè) 第24周，用50 ml注射器體外心臟采血，放入50 ml的離心管中，靜止1小時(shí)后，4000 r/min離心15分鐘后取血清，-20℃冰箱保存，待測(cè)試。hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1測(cè)定均采用酶聯(lián)免疫吸附(雙抗體夾心)法，根據(jù)試劑盒提供的試劑與實(shí)驗(yàn)步驟要求進(jìn)行操作，用MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀完成測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)觀察

正常對(duì)照組家兔主動(dòng)脈血管內(nèi)膜比較光滑，無(wú)粥樣病損，無(wú)脂質(zhì)斑塊形成。光鏡下內(nèi)皮細(xì)胞完整，內(nèi)彈力膜清晰，未見斷裂，內(nèi)膜無(wú)增厚，中膜平滑肌細(xì)胞排列有序，外膜纖維結(jié)締組織未見異常。模型組家兔主動(dòng)脈內(nèi)膜粗糙不平，肉眼可見淺黃色條紋或大小不等斑塊隆起，光鏡下可見血管內(nèi)膜增厚明顯，內(nèi)皮細(xì)胞脫落，粥樣斑塊形成，內(nèi)皮下見脂質(zhì)浸潤(rùn)，脂質(zhì)核心大，脂質(zhì)核心內(nèi)大量泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中膜平滑肌細(xì)胞增殖，向內(nèi)膜遷移，斑塊內(nèi)可見新生的小血管。相比之下，給藥組(額爾敦—烏日勒組和辛伐他汀組)家兔主動(dòng)脈病變程度相對(duì)較輕，光鏡下可見主動(dòng)脈內(nèi)皮有不同程度損傷，脫落，內(nèi)皮細(xì)胞下有少量泡沫細(xì)胞聚集,平滑肌排列比較規(guī)則。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，額爾敦—烏日勒組FCT、FCT/IMT比值均高于模型組(P<0.01)，與辛伐他汀組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 額爾敦—烏日勒對(duì)AS家兔主動(dòng)脈病理形態(tài)的影響

注：與模型組比較，aP<0.01；與辛伐他汀組比較，bP<0.05

2.2 血清炎性因子的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組家兔血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1水平較正常明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，額爾敦—烏日勒能明顯降低動(dòng)脈粥樣硬化家兔hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與辛伐他汀組比較，在降低模型組家兔的hs-CRP和MCP-1方面亦具有一定優(yōu)勢(shì)(P<0.05)，見表2。

表2 額爾敦—烏日勒對(duì)AS家兔血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1含量的影響

注：與正常組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01;與辛伐他汀組比較,cP<0.05

3 討論

已經(jīng)有許多研究表明，血清炎性因子hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1等可作為反映AS斑塊穩(wěn)定程度的炎癥標(biāo)志物，是心血管疾病危險(xiǎn)預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)。hs-CRP多方面參與了動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制，如能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞攝入低密度脂蛋白，有助于泡沫細(xì)胞的形成；激活粥樣斑塊內(nèi)的補(bǔ)體系統(tǒng)導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，增強(qiáng)不穩(wěn)定性斑塊的血管活性等。hs-CRP可以直接誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，因此CRP是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。hs-CRP誘導(dǎo)內(nèi)皮產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)，上調(diào)ICAM-1、VCAM-1，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞攝入天然LDL，使單核細(xì)胞組織因子增加，引起動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，最終導(dǎo)致斑塊和血栓形成[7]。大量實(shí)驗(yàn)病理學(xué)和分子生物學(xué)的研究資料證明，ICAM-1和VCAM-1可介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的滾動(dòng)和穩(wěn)定黏附，并繼而在單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)等炎癥因子的協(xié)助下穿越血管表層，啟動(dòng)局部的炎癥反應(yīng)，因而在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。MCP-1作為趨化因子家族中的一員，在AS病變?cè)缙冢饕勤吇瘑魏思?xì)胞向血管內(nèi)膜遷移，活化為巨噬細(xì)胞，在AS晚期，則對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增生和向血管內(nèi)膜的遷移具有趨化增殖的作用，同時(shí)通過(guò)誘導(dǎo)組織因子的表達(dá)，促進(jìn)血栓形成[8]。

近年來(lái)蒙醫(yī)藥對(duì)冠心病的研究，不論在病因病機(jī)、臨床癥狀治療及蒙醫(yī)分型研究方面均取得了一定的成果。傳統(tǒng)蒙藥額爾敦—烏日勒是蒙醫(yī)治療“白脈病”(類似于腦出血、腦血栓、神經(jīng)損傷、神經(jīng)根炎等腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病)、“協(xié)日烏素”(風(fēng)濕、類風(fēng)濕等病)、“薩病”(中風(fēng)或腦卒中)的常用蒙成藥，由珍珠、石膏、丁香、紅花、土木香、木香、檀香、地錦草、沉香、麝香、牛黃、水牛角、炯麻子、白苣勝等29味純天然藥材組成。近些年對(duì)額爾敦—烏日勒的研究逐步深入，臨床研究表明其治療腦梗塞、腦血栓、冠心病、心絞痛等心腦血管疾病療效顯著[9-11]。

本研究結(jié)果顯示，傳統(tǒng)蒙藥額爾敦—烏日勒能明顯降低動(dòng)脈粥樣硬化家兔血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與辛伐他汀組比較，在降低模型組家兔的hs-CRP和MCP-1面亦具有一定優(yōu)勢(shì)(P<0.05)。從病理形態(tài)學(xué)檢查看，能增加斑塊表面纖維帽厚度、改善纖維帽與內(nèi)中膜厚度比值?？傊陨辖Y(jié)果表明額爾敦—烏日勒可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，降低hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1上升水平來(lái)發(fā)揮抗AS的形成、發(fā)展和穩(wěn)定易損斑塊的作用。

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(本文編輯：蒲曉田)

Influencesofserumhs-CRPandrelevantinflammatoryfactorsonrabbitatheroscleroticvulnerableplaquemodelwithEerdun-wurili

Wulanqiqige,MAChun-jie,Hurilebagen,etal.

CollegeofBasicMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

MAChun-jie,E-mail:13514819729@163.com

ObjectiveTo observe the influences of serum high sensitivity C-reactive protein (hs-CRP), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), intercellular adhesion molecule (ICAM-1), and vascular adhesion molecule-1 (VCAM-1) on rabbit model of atherosclerotic vulnerable plaque with Eerdun-wurili and explore its possible mechanism.MethodsFifty New Zealand rabbits were randomly divided into 4 groups: the normal control group, the model group, the Eerdun-wurili group and the smivastatin group.The model was established by high fatty diet feeding,combined with immune injury and femoral arterial balloon tearing. From the 8th week the medication was given and the levels of serum hs-CRP，MCP-1，ICAM-1 and VCAM-1 were measured at the 24th week of experiment. Tissue structure of aortic were observed under light microscope.ResultsAortic lesions is relatively milder in the Eerdun-wurili group and the fibrous cap thickness and lntima media thickness ratios in the Eerdun-wurili group were higher than those of model group; besides, the levels of serum hs-CRP,、ICAM-1,、VCAM-1、and MCP-1 were decreased significantly (P<0.01).ConclusionEerdun-wurili could prevent AS formation and stabilize atherosclerosis vulnerable plaque. It acts by suppressing the inflammation reaction.

Eerdun-wurili; Atherosclerosis; High-sensitivity C-reactive protein; Inflammatory factors; Rabbits

國(guó)家自然科學(xué)基金(81160464)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院[烏蘭其其格(博士研究生)]；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院(烏蘭其其格、呼日樂(lè)巴根、海英、布和朝魯、白龍)，中醫(yī)學(xué)院(麻春杰、邸彥清)

烏蘭其其格(1979- ),女，2011級(jí)在讀博士研究生，實(shí)驗(yàn)師。研究方向：蒙藥藥理研究。E-mail:mywulan2008@163.com

麻春杰(1956- )，女，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師。研究方向：中(蒙)醫(yī)藥防治心腦血管疾病的研究。E-mail:13514819729@163.com

R29

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.03.005

2013-12-19)