劉超美， 仲淑賢， 楊利寧，鄔夢璐， 葉建萍， 陳建榮，

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.浙江師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

厚樸酚與和厚樸酚互為同分異構(gòu)體，是我國傳統(tǒng)中藥厚樸的主要活性成分，廣泛用于臨床治療，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抑制血小板聚集等藥理作用[1].因此,建立一種靈敏簡便的分析方法用于活性成分的質(zhì)量控制非常有必要.目前,用于定量測定厚樸酚與和厚樸酚含量的方法有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、薄層掃描法和紫外分光光度法等[2-5].

濁點萃取技術(shù)(CPE)是近年來出現(xiàn)的一種液-液萃取新技術(shù)，它是一種利用表面活性劑的增溶和濁點現(xiàn)象，將體系分為兩相，使目標(biāo)物進(jìn)入表面活性劑富集相，從而進(jìn)行分離與濃縮的萃取技術(shù).該技術(shù)具有綠色環(huán)保、操作簡便等優(yōu)點.濁點萃取技術(shù)已成功用于金屬離子和有機(jī)物的測定[6-10].本文以Triton X-114為表面活性劑，將體系分為上層水相和下層表面活性劑富集相，采用濁點萃取-紫外分光光度法聯(lián)用技術(shù),成功實現(xiàn)了對藥材中厚樸酚與和厚樸酚含量的測定.

1 實驗部分

1.1 儀器

Lambda 25紫外分光光度計(美國Perkin Elmer公司)，PDC-2010低溫恒溫槽(寧波萊?？萍加邢薰?，PP-50型精密pH計(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)，Hettich Rotanto460型高速離心機(jī)(德國)，AL204型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，Milli-Q 超純水系統(tǒng)(Millipore公司).

1.2 試劑

厚樸酚與和厚樸酚的標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁試劑有限公司，AR,純度>99.7%)：取0.20 g標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，臨用時用甲醇稀釋至所需的濃度.配制不同pH值的B-R(Britton-Robinson)緩沖溶液及其他緩沖溶液所需要的KH2PO4,NH4Cl,NaOH,Na2B4O7·10H2O等試劑均為分析純試劑.所有標(biāo)準(zhǔn)溶液在黑暗處4 ℃保存.

非離子型表面活性劑Triton X-114(Sigma-Aldrich，Germany)：稱取25 g于500 mL容量瓶中,用二次水配制成50 g/L的Triton X-114溶液.

1.3 實驗過程

1.3.1 濁點萃取過程

準(zhǔn)確移取2.50 mL厚樸酚(10 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液與1.25 mL和厚樸酚(10 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液于50.0 mL

A:含有萃取物的初始溶液;B:加入表面活性劑后萃取物與膠束結(jié)合;C:發(fā)生濁點相分離，離心后萃取物富集在膠束相圖1 濁點萃取過程

離心管中,分別加入0.6 mL 5%的Triton X-114溶液，用5 mL B-R緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值為6，用二次水定容至50 mL，充分振蕩混勻后，置于45 ℃恒溫水浴中平衡15 min.為促進(jìn)兩相快速分離，以4 000 r/min離心 10 min，離心后表面活性劑相在下層，冰水浴冷凍后棄去上層液，試管底部得到300 μL表面活性劑富集相(見圖1).

1.3.2 檢測方法

單組分的檢測：按照上述方法進(jìn)行濁點萃取，得到表面活性劑富集相，用甲醇稀釋到1.0 mL，在最大吸收波長290 nm處測定厚樸酚與和厚樸酚的吸光度.

圖2 厚樸酚與和厚樸酚的最大吸收峰

混合樣的同時測定：按照上述方法萃取到的表面活性劑富集相用甲醇稀釋至1 mL，再加入pH=9的KH2PO4-NaOH緩沖溶液1 mL，然后移入1 mL微量比色皿中,測定在290 nm和320 nm處樣品的吸光度，分別記作A290和A320，未加厚樸酚與和厚樸酚的空白溶液作為對照.

1.3.3 測定原理

在中性溶液中，厚樸酚與和厚樸酚的最大吸收波長幾乎重疊.利用兩者羥基質(zhì)子離解性的差異，在它們的混合液中加入緩沖溶液，厚樸酚解離而和厚樸酚不解離，使厚樸酚的最大吸收峰紅移，這樣兩者的吸收峰不再重疊.吸收波長的選擇如圖2所示.根據(jù)吸光度的加和性，可以計算出厚樸酚與和厚樸酚的含量.

A320(總)=ε320(厚樸酚)·C(厚樸酚)+ε320(和厚樸酚)·C(和厚樸酚);

A290(總)=ε290(厚樸酚)·C(厚樸酚)+ε290(和厚樸酚)·C(和厚樸酚).

2 結(jié)果與討論

2.1 濁點萃取條件的選擇

圖3 pH對濁點萃取的影響

2.1.1pH對萃取效率的影響

萃取效率取決于待測化合物的性質(zhì)和表面活性劑的性質(zhì).厚樸酚與和厚樸酚均是弱酸性化合物，厚樸酚的解離常數(shù)pKa1和pKa2分別是7.54和14.38[11],溶液pH影響著分析物的存在形式.濁點萃取的其他條件如上所述，為了提高萃取效率，考察了pH 3～10范圍內(nèi)溶液的酸度對待測物萃取效果的影響.圖3表明，在pH值為6時目標(biāo)物的萃取量最大.因此，選擇萃取體系的最佳pH值為6.

2.1.2 Triton X-114濃度的影響

Triton X-114具有較低的濁點溫度(23～26 ℃)和較高的密度,可有助于相分離，在濁點萃取技術(shù)中常用作萃取劑.同時,Triton X-114的用量會影響富集相的體積，從而影響萃取率.在保證完全萃取的前提下，應(yīng)減小表面活性劑的體積以提高相比.本實驗研究了0.03%～0.09%的Triton X-114溶液對萃取的影響.從圖4可知，選擇體積分?jǐn)?shù)為0.06%的Triton X-114溶液可以達(dá)到最高的萃取效率.

2.1.3 水浴溫度和平衡時間的影響

平衡溫度高于表面活性劑的濁點溫度時才會引發(fā)相分離，提高溫度，縮短萃取時間，對濁點萃取起著至關(guān)重要的作用.本實驗考察了25～60 ℃范圍內(nèi)溫度對萃取率的影響.圖5中達(dá)到最高萃取率的溫度為45 ℃.

圖4 Triton X-114濃度對濁點萃取的影響

圖5 平衡溫度對濁點萃取的影響

平衡時間的延長有利于增加分配比，但同時會影響實驗周期.本實驗研究了5～35 min的平衡時間對萃取率的影響，最終選擇15 min作為平衡時間.

2.2 檢測條件的選擇

2.2.1 稀釋劑用量的選擇

濁點萃取后待測物進(jìn)入富集相，為保證比色皿中相的均一性，需要對表面活性劑相進(jìn)行稀釋，降低樣液的黏度.甲醇可以較好地溶解Triton X-114，故本實驗選擇甲醇作為稀釋劑.本實驗對不同的甲醇用量進(jìn)行了考察.當(dāng)甲醇稀釋后樣液的體積小于1 mL時，Triton X-114對待測物峰形的干擾較大，所以稀釋劑甲醇的用量為1 mL.

2.2.2 緩沖體系及其pH的選擇

配制不同pH值的KH2PO4-NaOH，Na2B4O7-HCl和NH4Cl-NH3·H2O緩沖溶液，分別按照上述方法萃取和測定.由于KH2PO4-NaOH體系的干擾相對最小，樣品的峰形好，所以本實驗選擇該體系.在其他條件不變時改變緩沖溶液的用量，發(fā)現(xiàn)其用量為1 mL時可以得到較好的峰形.體系pH值為8.5～9.0時,厚樸酚已經(jīng)解離,其最大吸收峰紅移到320 nm處；而和厚樸酚未解離,其最大吸收峰還在290 nm處.故本實驗選擇pH=9的KH2PO4-NaOH緩沖溶液.

2.3 分析特性

在已確定的最佳條件下，分別對方法的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢測限和富集倍數(shù)進(jìn)行了研究.建立了吸光度與對應(yīng)質(zhì)量濃度的線性回歸方程，結(jié)果見表1，其中5次測定厚樸酚、和厚樸酚的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.75%和1.49%.厚樸酚、和厚樸酚的檢測限分別為2.5和1.0 μg/L，富集倍數(shù)為25，表明在最佳條件下能定量萃取.其他數(shù)據(jù)如表1所示.

表1 線性回歸方程和檢測限(n=5)

2.4 樣品分析及回收率實驗

準(zhǔn)確稱取0.20 g厚樸藥材(產(chǎn)地:浙江),加入1 L水于燒杯中，電爐煮沸40 min，冷卻后用定性濾紙過濾以除去懸浮在水中的微粒.取50 mL樣品溶液于50 mL離心管中，按照上述濁點萃取和檢測方法處理，測得厚樸藥材中厚樸酚與和厚樸酚的含量見表2.采用加標(biāo)回收率法驗證方法的準(zhǔn)確性和可行性，實驗結(jié)果見表2，厚樸酚的加標(biāo)回收率為102.0%～104.3%，和厚樸酚的加標(biāo)回收率為98.37%～104.3%.

表2 樣品測定結(jié)果和加標(biāo)回收率

3 結(jié) 論

本文建立了一種濁點萃取-分光光度法同時測定厚樸酚與和厚樸酚的新方法，以Triton X-114為表面活性劑對厚樸酚與和厚樸酚同時濁點萃取，提高了方法的選擇性和靈敏度，同時利用二者pKa的差異，調(diào)節(jié)測定液pH使二者的紫外光譜出現(xiàn)不同，利用同一波長下吸光度的加和性，從而同時測得厚樸酚及和厚樸酚的含量.與其他文獻(xiàn)方法相比，本方法具有操作快速、簡便及成本低廉等優(yōu)點.

[1]劉可云，董志，朱毅.厚樸酚與和厚樸酚的藥理學(xué)研究現(xiàn)狀[J].中成藥，2006,28(5):716-718.

[2]蘇健,王寶琴.厚樸及其制劑中厚樸酚、和厚樸酚含量測定方法研究綜述[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2002,9(9):35-37.

[3]劉西茜，董慧茹,傅海珍.溶劑浮選分離-紫外分光光度法測定環(huán)境水樣中羅紅霉素殘留量[J].理化檢驗:化學(xué)分冊,2008,27(10):96-98.

[4]張海江，郭懷忠,楊曉萍,等.固相萃取-高效液相色譜法測定藿香正氣口服液中厚樸酚與和厚樸酚的含量[J].藥物分析雜志,2009,29(2):316-319.

[5]陳穎,段建平,陳紅青,等.毛細(xì)管電泳安培檢測法同時測定厚樸酚與和厚樸酚[J].福州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,35(4):612-615.

[6]肖珊美,陳建榮,沈玉勤.雙硫腙濁點萃取-石墨爐原子吸收光譜法測定環(huán)境水樣中痕量鉛的研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2006,26(5):955.

[7]楊利寧,趙玲玲,陳建榮.濁點萃取-原子光譜法在金屬離子形態(tài)分析中的應(yīng)用[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2012，35(4):426-431.

[8]Chen Jianrong,Teo K C.Determination of cadmium,copper,lead and zinc in water samples by flame atomic absorption spectrometry after cloud point extraction[J].Analytica Chimica Acta,2001,450(1):215-222.

[9]孫博思,任婷,趙麗嬌,等.濁點萃取-高分辨連續(xù)光源石墨爐原子吸收光譜法測定環(huán)境水樣中的痕量鉛[J].光譜學(xué)與光譜分析,2012,32(10):2847-2852.

[10]Zhong Shuxian,Tan S N,Ge Liya,et al.Determination of bisphenol A and naphthols in river water samples by capillary zone electrophoresis after cloud point extraction[J].Talanta,2011，85(1)：488-492.

[11]保志娟,楊雪瓊,鄒永明,等.厚樸酚與和厚樸酚清除DPPH·的作用[J].云南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2005,27(1):60-63.