李武國，劉嘉煒，李慶國，葉玉珊，司馬貞華

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

虎杖為蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.)的干燥根莖，具有散瘀定痛、祛風(fēng)利濕、止咳化痰之功效。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，主要用于咳嗽痰多、關(guān)節(jié)痹痛、濕熱黃疸、癰腫瘡毒和癓瘕等病癥[1]；現(xiàn)代藥理研究表明，虎杖具有抗流感病毒、抗艾滋病毒、抗菌、抗腫瘤和抗炎癥等藥理作用[2]。利用傳統(tǒng)植物化學(xué)手段對虎杖化學(xué)成分進(jìn)行研究表明，其根莖部位主要含有聯(lián)苯乙烯類、醌類和黃酮類等化學(xué)成分[3-4]，其中，對聯(lián)苯乙烯類白藜蘆醇衍生物和蒽醌類衍生物的提取分離研究較為深入，其萃取方法有溶劑萃取、超聲波輔助萃取和微波輔助萃取等[5-6]；利用水蒸氣蒸餾法提取虎杖揮發(fā)油的GC/MS分析結(jié)果表明，其根莖部位還含有噻吩類、菲類、萘類和聯(lián)苯類等揮發(fā)性化學(xué)成分[7]；但利用超臨界CO2萃取虎杖根莖揮發(fā)性化學(xué)成分，并采用GC/MS法對其進(jìn)行分析還未見報道。與傳統(tǒng)的萃取方法(如水蒸氣蒸餾、有機溶劑萃取等)相比，超臨界CO2萃取是一種新型的現(xiàn)代“綠色分離”技術(shù)，具有無溶劑殘留、無熱分解破壞、對揮發(fā)性小分子化合物的提取效率高等優(yōu)點[8]。

近年來，本課題組利用植物化學(xué)研究方法對虎杖根莖活性化學(xué)成分進(jìn)行了深入研究，基于藥理活性導(dǎo)向法從虎杖提取物中分離鑒定出一組H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑[3]和新型IL-6/STAT3信號通路抑制劑[9]。這為植物來源靶向抗流感病毒和抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了結(jié)構(gòu)信息和參考，同時還發(fā)現(xiàn)該藥材乙酸乙酯提取物含有一些低極性化合物，其成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)相似，利用傳統(tǒng)植物化學(xué)方法難以純化分離獲得單體化合物來進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。為了從不同角度探討虎杖根莖部位的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用超臨界CO2萃取技術(shù)對其根莖粉末進(jìn)行萃取，對萃取物進(jìn)行GC/MS分離分析，并利用體外傷口愈合模型評價其抗細(xì)胞遷移活性。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

HA121-50-05型超臨界流體萃取儀：江蘇華安科研儀器有限公司產(chǎn)品；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；Voyager型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Finnigan公司產(chǎn)品，配有NIST05質(zhì)譜檢索庫；3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；CKX41型相差倒置顯微鏡：日本Olympus公司產(chǎn)品；TC10型細(xì)胞計數(shù)儀：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；TGL-16G型高速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

虎杖藥材(批號：091101)：購自廣州致信藥業(yè)有限公司，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室彭光天博士鑒定；人肝癌細(xì)胞株Huh-7：由鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院提供；二氧化碳(純度99.9%)、氦氣(純度99.99%)、95%乙醇、無水硫酸鈉、DMSO、乙醚及其他試劑均為分析純；DMEM培養(yǎng)液(C11995)、PBS緩沖液(C10010)、胎牛血清(10099)、0.25% Trypsin-EDTA(25200)、Pen Strep(15140)：均為美國Gibco公司產(chǎn)品。

1.3 實驗條件

1.3.1虎杖根莖超臨界CO2萃取物的萃取

取2 kg粉碎后的虎杖根莖，過50目篩，裝入超臨界萃取釜中，萃取壓力為20 MPa，萃取溫度為45 ℃，加入一定量95%乙醇作為夾帶劑，萃取時間為2 h。其中，分離釜I的溫度為45 ℃，壓力為5.4 MPa；分離釜II的溫度為50 ℃，壓力為5.4 MPa。

1.3.2樣品處理 超臨界萃取物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收夾帶劑乙醇，取適量浸膏，用乙醚配制成50 g/L溶液，加適量無水Na2SO4，脫水干燥，過0.45 μm微孔濾膜，將濾液進(jìn)行GC/MS分析。

1.3.3氣相色譜條件 TG WAXMS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：初始溫度50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度220 ℃；載氣為高純氦氣，載氣流速1 mL/min，恒流模式；分流進(jìn)樣，分流比30∶1，進(jìn)樣量1 μL。

1.3.4質(zhì)譜條件 離子源溫度200 ℃，接口溫度230 ℃；電離方式為電子轟擊(EI)源，電子轟擊能量70 eV；全掃描模式，掃描速度1 975.50 u/s，掃描范圍m/z35～600；溶劑延遲時間3 min。

1.3.5相對百分含量的計算 各化學(xué)成分通過NIST Search2.0標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫進(jìn)行檢索匹配，并人工解析質(zhì)譜，以確證化合物的結(jié)構(gòu)；采用峰面積歸一法計算分離鑒定化學(xué)成分的相對百分含量。

1.3.6體外細(xì)胞遷移測試(傷口愈合模型)[10]

體外培養(yǎng)人來源的肝癌Huh-7細(xì)胞株，Huh-7細(xì)胞生長至約80%融合時，收集對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞，胰酶消化后計數(shù)，在6孔板中每孔加入約106個細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞接種于6孔板24 h后，吸取各孔中的培養(yǎng)液，用200 μL移液槍頭垂直于背后的橫線劃痕，造成傷口愈合細(xì)胞遷移模型，無鈣PBS沖洗細(xì)胞表面3次以去除細(xì)胞殘骸和碎片?？瞻讓φ战M每孔加入2.5 mL 含0.1% DMSO和2% FBS的DMEM培養(yǎng)液，給藥組每孔加入2.5 mL 含2% FBS和不同濃度(1、5、10 mg/L)虎杖萃取物的DMEM培養(yǎng)液，每組3個復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)，0、24、48 h分別在倒置顯微鏡下拍照，并用image j計算遷移面積。采用SPSS11.0軟件對各組細(xì)胞遷移數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，并對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。

1.3.7體外細(xì)胞毒性測試[11]體外培養(yǎng)人肝癌Huh-7 細(xì)胞株，細(xì)胞生長至約80% 融合時，收集對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞，消化后計數(shù)，在96孔板中每孔加入約104個細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞接種于96孔板24 h后，吸取各孔中的培養(yǎng)液，空白對照組每孔加入200 μL含0.4% DMSO和10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，給藥組每孔加入200 μL含10% FBS和不同濃度(0、1、5、10、20、40、60、80、100 mg/L)虎杖

根莖超臨界CO2萃取物的DMEM培養(yǎng)液，每組平行設(shè)置3個孔，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL 5 g/L MTT，培養(yǎng)4 h，吸取培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min。用酶標(biāo)儀490 nm測定OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗結(jié)果

2.1.1超臨界CO2萃取及GC/MS分析 在本實驗條件下，2 kg虎杖根莖藥材粉末經(jīng)超臨界CO2流體萃取，得到4.8 g浸膏，得率為0.24%；對萃取物進(jìn)行GC/MS分析，得到的總離子流圖示于圖1。在虎杖根莖超臨界CO2萃取物總離子流圖中，共分離獲得65個化學(xué)組分峰，其中鑒定確證33個化合物，占總檢測到化學(xué)成分相對百分含量的93.6%，詳情列于表1。含量較高的化合物是2,3-丁二醇、吉瑪烯B、醋酸、丙二醇和莪術(shù)烯等，分別占5.9%、6.5%、6.9%、12.2%和41.8%，其中莪術(shù)烯含量最高，是虎杖超臨界CO2萃取物的主要化學(xué)成分之一。

2.1.2體外人肝癌Huh-7 細(xì)胞遷移和細(xì)胞毒活性測試 虎杖根莖超臨界CO2萃取物對體外傷口愈合模型Huh-7細(xì)胞遷移測試實驗的結(jié)果示于圖2a和2b。與空白組比較，在濃度為1 mg/L和5 mg/L時，虎杖根莖超臨界CO2萃取物對人肝癌細(xì)胞Huh-7的細(xì)胞遷移活性均沒有明顯抑制效果，但在濃度為10 mg/L作用24 h時，能較顯著地抑制人肝癌細(xì)胞Huh-7的細(xì)胞遷移活性，抑制率為19.85%(p<0.01)。為了進(jìn)一步驗證虎杖根莖超臨界CO2萃取物抑制細(xì)胞遷移活性與其細(xì)胞毒活性的關(guān)系，用不同濃度(0、1、5、10、20、40、60、80、100 mg/L)萃取物分別處理人肝癌Huh-7細(xì)胞 24 h。MTT法測試表明，虎杖根莖萃取物在濃度為10 mg/L和20 mg/L時，對人肝癌Huh-7細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活沒有影響；萃取物在濃度為20 mg/L以下時，沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性；但在濃度大于 40 mg/L時，對細(xì)胞增殖表現(xiàn)出抑制效果，其IC50= 38.6 mg/L，示于圖2c?？梢姡⒄雀o超臨界CO2萃取物在濃度為10 mg/L時，抑制Huh-7細(xì)胞遷移的生物機制與其細(xì)胞毒活性無直接相關(guān)。

圖1 虎杖根莖SFE-CO2萃取物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of the SFE-CO2 extracts from the rhizomes of Polygonum cuspidatum

峰號保留時間/min化合物名稱分子式相對分子質(zhì)量匹配度/%質(zhì)量百分?jǐn)?shù)/%18.0 3-甲基-2-丁醇3-Methyl-2-butanol C5H12O8879.10.5 210.0 羥基丁酮Acetoin C4H8O28887.10.6 314.5 醋酸Acetic acid C2H4O26088.76.9 415.3 古巴烯Copaene C15H2420491.30.3 516.0 β-綠葉烯β-Patchoulene C15H2420480.70.1 616.1 α-古蕓烯α-Gurjunene C15H2420480.70.2 716.3 δ-新丁香三環(huán)烯δ-Neoclovene C15H2420473.30.4 816.4 丙二醇Propylene glycol C3H8O27672.112.2 917.4 異丁子香烯IsocaryophilleneC15H2420482.80.3 1017.6 2,3-丁二醇2,3-Butanediol C4H10O29092.15.9 1117.9 丁子香烯Caryophyllene C15H2420494.00.7 1218.9 甘香烯Elixene C15H2420489.80.3 1319.6 α-石竹烯α-Caryophyllene C15H2420492.40.4 1420.1 β-雪松烯β-Himachalene C15H2420483.30.1 1520.8 β-桉葉烯β-Eudesmene C15H2420492.61.7 1620.8 α-姜烯α-Zingiberene C15H2420484.30.1 1720.9 α-衣蘭油烯α-Muurolene C15H2420485.40.1 1821.1 雅欖藍(lán)烯EremophileneC15H2420484.00.2 1921.7 δ-蓽澄茄烯δ-Cadinene C15H2420484.70.1 2022.0 β-倍半水芹烯β-Sesquiphellandrene C15H2420489.20.2

續(xù)表

峰號保留時間/min化合物名稱分子式相對分子質(zhì)量匹配度/%質(zhì)量百分?jǐn)?shù)/%2122.1 β-人參烯β-Panasinsene C15H2420488.05.8 2222.6 γ-欖香烯γ-Elemene C15H2420487.60.8 2323.2 吉瑪烯B Germacrene B C15H2420486.16.5 2423.9 脫氫香橙烯Dehydro-aromadendrene C15H2220282.40.5 2524.59,10-脫氫異長葉烯9,10-Dehydro-isolongifolene C15H2220286.10.72627.7 反式桂皮醛 (E)-Cinnamaldehyde C9H8O13290.00.1 2729.3 莪術(shù)烯Curzerene C15H20O21678.741.8 2832.5 長馬鞭草烯酮Longiverbenone C15H22O21882.10.9 2933.7 (-)-斯巴醇 (-)-Spathulenol C15H24O22079.70.1 3035.24,5-脫氫異長葉烯4,5-Dehydro-isolongifolene C15H2220280.82.63137.12-(4a,8-二甲基-2,3,4,4a,5,6-六氫化-奈-2-基)-丙烯-2-乙二胺-1-醇2-(4a,8-Dimethyl-2,3,4,4a,5,6-hexahydro-naphthalen-2-yl)-prop-2-en-1-ol C15H22O21877.90.43242.1 n-棕櫚酸n-Hexadecanoic acid C16H32O225680.20.5 3343.38,9-脫氫-9-甲酰基-環(huán)異長葉烯8,9-Dehydro-9-formyl-cycloisolongifolene C16H22O23076.61.8

注：a.b.體外傷口愈合模型評價虎杖根莖SFE-CO2萃取物對人肝癌細(xì)胞Huh-7的抑制細(xì)胞遷移活性(*p<0.05, 與48 h空白比較，**p<0.01, 與24 h空白比較)； c.MTT法評價SFE-CO2萃取物的細(xì)胞毒活性圖2 虎杖根莖SFE-CO2萃取物對人肝癌Huh-7 細(xì)胞遷移和細(xì)胞毒活性的作用結(jié)果Fig.2 Anti-migration and cytotoxic effects of the supercritical extracts from the rhizomes of Polygonum cuspidatum towards human hepatoma Huh-7 cells

2.2 討論

本研究采用超臨界CO2萃取虎杖根莖的低極性成分，經(jīng)GC/MS分析，共分離獲得65個化學(xué)組分峰，并鑒定了其中33種化合物，主要成分為莪術(shù)烯、丙二醇、醋酸、吉瑪烯B和2,3-丁二醇等化合物。與文獻(xiàn)[7]相比，本研究的方法能獲得更多的化學(xué)成分，而且在主要化學(xué)成分的種類上也有很大差異。

體外傷口愈合模型測試表明，虎杖超臨界CO2萃取物在濃度為10 mg/L作用24 h和48 h時，均能較顯著地抑制人肝癌細(xì)胞Huh-7的細(xì)胞遷移活性；MTT法測試表明，虎杖超臨界CO2萃取物在濃度低于20 mg/L時，對Huh-7細(xì)胞的增殖和存活無抑制作用，其體外細(xì)胞毒活性IC50為38.6 mg/L。因此，虎杖萃取物抑制細(xì)胞遷移的生物活性機制與其細(xì)胞毒性無直接相關(guān)，其生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)可能是萃取物中含量較高的化學(xué)成分，如莪術(shù)烯等。本實驗中，莪術(shù)烯是虎杖超臨界CO2萃取物相對百分含量較高的成分，占萃取物的 41.8%，因此，莪術(shù)烯很可能是虎杖超臨界CO2萃取物中抑制人肝癌Huh-7細(xì)胞遷移活性的主要成分之一。莪術(shù)烯是呋喃二烯結(jié)構(gòu)化合物[12]，該化合物能通過PI3K 信號途徑下調(diào)細(xì)胞內(nèi)p-Akt, p-Erk 1/2, ICAM-1, p-p85和 p85的蛋白表達(dá)水平，從而抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和血管形成[13]，還能通過MAPK等信號途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和腫瘤侵襲[14-16]。另外，莪術(shù)烯也是很多植物揮發(fā)油的主要成分之一，如莪術(shù)[17]、紅果子[18]和Benitez[19]等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，莪術(shù)烯對 THP-l 細(xì)胞分泌TNFα炎癥因子有明顯的抑制作用[20]，對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO表現(xiàn)出顯著的抑制活性, IC50為9.4 μmol/L[21]。據(jù)此推測，莪術(shù)烯可能是虎杖的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，值得進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

利用超臨界CO2萃取技術(shù)對虎杖根莖粉末進(jìn)行萃取，并對萃取物進(jìn)行GC/MS分離分析，得到65個化學(xué)組分峰，鑒定了其中的33個化合物，主要成分為莪術(shù)烯，進(jìn)一步測試表明，虎杖根莖超臨界CO2萃取物的非細(xì)胞毒劑量對人肝癌細(xì)胞Huh-7的細(xì)胞遷移活性具有抑制效果。

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