王道兵，鐘其頂，高紅波，程 濤，黃占斌

(1. 中國礦業(yè)大學(xué)(北京)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083；2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027；3.全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100027)

葡萄酒品質(zhì)的優(yōu)劣取決于是否用優(yōu)質(zhì)的原料釀制而成，是否在工藝過程中添加了禁用的添加劑。由于我國的葡萄原料供給不充裕，同時受當(dāng)前檢測技術(shù)水平的限制，還不能通過數(shù)據(jù)客觀地反映這些指標(biāo)，因此近年來屢有發(fā)生以半汁葡萄酒假冒全汁葡萄酒，產(chǎn)品年份、產(chǎn)地、品種亂標(biāo)的現(xiàn)象，這嚴重違反了行業(yè)內(nèi)的公平競爭，損害了行業(yè)利益，也給消費者帶來了安全隱患。

穩(wěn)定同位素技術(shù)的發(fā)展對于開展葡萄酒真實性鑒別具有重要意義[1-3]，尤其是葡萄酒水中氧同位素比值(δ18O)在產(chǎn)品摻水鑒別和產(chǎn)地溯源方面有很高的應(yīng)用價值[4-12]。國際葡萄與葡萄酒組織(O.I.V)已制定了測定葡萄酒水中δ18O的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[13]，然而，目前測定葡萄酒水中δ18O的標(biāo)準(zhǔn)方法主要為離線二氧化碳-水平衡法，該分析方法不僅存在樣品量大、勞動強度大、對實驗人員要求高等特點，且無法實現(xiàn)全自動進樣、分析效率低，難以滿足大規(guī)模連續(xù)測定，因此使得水中δ18O在葡萄酒真實性鑒別中的應(yīng)用進展緩慢。近年來，在線二氧化碳-水平衡系統(tǒng)得到快速發(fā)展，Paul等[14]研究了不同因素對GasBench-IRMS測定二氧化碳中δ18O穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性的影響，并對實驗條件進行了優(yōu)化；杜廣鵬等[15]驗證了排空時間對二氧化碳中δ18O測定穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的影響；孫青等[16]應(yīng)用GasBench II-IRMS分析天然水樣中δ18O，穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性均比較理想；張琳等[17]對離線水平衡-雙路進樣法和GasBench II-IRMS法進行了比較，2種方法測定水中δ18O的精密度和準(zhǔn)確度基本一致，均能得到較好的分析數(shù)據(jù)。

本研究通過優(yōu)化方法參數(shù)，建立GasBench-IRMS測定葡萄酒水中δ18O的方法，探討可大規(guī)模連續(xù)進樣測定葡萄酒水中δ18O的在線分析技術(shù)，以用于葡萄酒摻水的鑒別。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

GasBench II前處理裝置：GC PAL自動進樣器，PoraPlot Q色譜柱(25 m×0.32 mm)，恒溫樣品盤(溫度精度±0.1 ℃)，硼硅酸鹽反應(yīng)瓶(12 mL)，進樣針和吹氣針；Delta V advantage檢測器：美國Thermo Finnigan公司產(chǎn)品，儀器控制軟件為ISODATE 3.0。

主要試劑：高純He、CO2標(biāo)準(zhǔn)氣、0.3%CO2和He混合氣，銅絲，活性碳粉末，乙醇(色譜純)。

GasBench II-IRMS分析CO2氣體中δ18O的精密度1σ<0.08‰，測定線性范圍為1～10 V(信號強度)。

1.2 實驗方法

設(shè)定恒溫樣品盤溫度為27 ℃，He壓力為80 kPa。在樣品瓶中加入銅絲、活性碳和樣品后，放入恒溫樣品盤中。固定進樣針和吹氣針，設(shè)定自動進樣器程序，充入0.3%CO2和He混合氣10 min，帶走瓶中的空氣。設(shè)定樣品充氣與樣品分析之間的間隔，使氣體CO2與水中氧發(fā)生同位素交換[18]。質(zhì)譜儀測定平衡后CO2同位素比值。

1.3 數(shù)據(jù)校正

在樣品測定過程中插入質(zhì)控水樣和標(biāo)準(zhǔn)水樣，依據(jù)Stephen等[19]報道的VSMOW/SLAP校正法進行校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響因素分析

基于二氧化碳-水平衡法測定水中δ18O時，反應(yīng)瓶氣密性、反應(yīng)時間、樣品性質(zhì)等均可能影響測定結(jié)果的有效性(以GasBench II-IRMS的測定精度0.15‰為評判基準(zhǔn))。

2.1.1反應(yīng)瓶氣密性 二氧化碳與水進行氧同位素交換時，即使采用振蕩方式促進反應(yīng)，也需5 h才能達到同位素交換平衡[13]。GasBench II-IRMS的優(yōu)勢是可一次性測定大量樣品，然而由于GasBench II-IRMS是在靜置狀態(tài)下進行交換反應(yīng)的，若此過程二氧化碳氣體滲漏則可能出現(xiàn)同位素動力分餾，影響水中δ18O測定的準(zhǔn)確性。

有研究[11]表明，超過24 h時，瓶內(nèi)CO2中δ18O呈偏重趨勢，即反應(yīng)瓶氣密性變化導(dǎo)致瓶內(nèi)氣體滲漏繼而出現(xiàn)同位素分餾。本研究向26個反應(yīng)瓶中充入0.3%CO2和He混合氣，間隔2 h進行測定，結(jié)果示于圖1。

各瓶中CO2的δ18O測定值的平均值為-1.03‰，SD為0.04‰(優(yōu)于測定誤差0.15‰)。從圖1可以看出，52 h內(nèi)，CO2的δ18O測定值僅在一定范圍內(nèi)(-0.94‰～-1.10‰)波動，沒有出現(xiàn)越來越偏正的情況，說明本研究所用的反應(yīng)瓶能夠保證至少52 h內(nèi)不出現(xiàn)同位素分餾現(xiàn)象。

2.1.2樣品體積的影響 有研究[20]報道，樣品水量為0.2、0.5、1 mL時，樣品水中氫或氧的量遠遠超過平衡物質(zhì)CO2物質(zhì)的量，平衡體系中CO2的初始同位素比值對分析結(jié)果沒有影響，即不同樣品體積對水中氫、氧同位素分析結(jié)果沒有明顯的干擾。然而孫青等[16]研究表明，測定值會隨樣品體積的增大而逐漸偏負，并且樣品水量較大時測量結(jié)果受體積的影響較小，而樣品水量較小時受體積的影響較大，詳細情況列于表1。

表1 樣品體積對葡萄酒水中δ18O測定的影響Table 1 Influence of sample volume on δ18O of water in wine

本研究針對葡萄酒樣品進行分析，結(jié)果表明，體積在200 μL時測定值的波動較大，而體積為500 μL時測定最穩(wěn)定。對比不同體積時的平均測定結(jié)果，雖然呈增大趨勢，但極差僅為0.16‰，與儀器測定誤差(0.15‰)相近。這說明在葡萄酒分析中，樣品體積在200～1 000 μL變化時不影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，但體積過小或過大時穩(wěn)定性較差。

2.1.3平衡時間的選擇 分別在12、16、20、24、32、40、48、72 h時測定，CO2/He混合氣與水發(fā)生氧同位素交換，結(jié)果示于圖2。反應(yīng)時間在12～24 h時測得的氧同位素值比較偏負，且呈現(xiàn)逐漸偏正的趨勢，這表明，水與CO2還未完全達到同位素平衡；而反應(yīng)時間在24～72 h時測得的結(jié)果比較穩(wěn)定，這說明當(dāng)平衡反應(yīng)進行24 h后開始測定是較適合的。

圖2 反應(yīng)時間對葡萄酒水中δ18O的影響Fig.2 Influence of equilibrium time on δ18O of water in wine

2.1.4乙醇對葡萄酒水中δ18O測定的影響

在葡萄酒中乙醇含量為7%～16%，GasBench II-IRMS采氣時[11,17]，通過進樣針用載氣將反應(yīng)瓶中的混合氣體(CO2、水蒸氣及其他)轉(zhuǎn)移至IRMS中進行分析，若將乙醇帶入IRMS中，由于乙醇的相對分子質(zhì)量為46，勢必會影響水中δ18O的測定。

為驗證乙醇對δ18O測定的影響，配制體積百分比分別為0、5%、10%、15%、20%的乙醇水溶液，測定其水中δ18O，結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，乙醇濃度在0～20%范圍時，不影響水中δ18O測定的穩(wěn)定性及結(jié)果準(zhǔn)確性，因此GasBench II-IRMS法適合進行葡萄酒水中δ18O測定。

表2 乙醇水溶液中水的δ18OTable 2 δ18O-value of water in ethanol-water solution

2.2 方法穩(wěn)定性

采用IRMS與GasBench II聯(lián)用，利用CO2-H2O平衡在線連續(xù)分析葡萄酒水中氧穩(wěn)定同位素組成，方法的恒溫樣品盤溫度為27 ℃，He壓力為80 kPa，向0.5 mL葡萄酒樣品中加入活性碳、銅絲后，與0.3%CO2和He混合氣平衡24～48 h，質(zhì)譜儀測定同位素交換平衡后CO2中δ18O，用標(biāo)準(zhǔn)水樣校正測定結(jié)果。

為驗證方法的穩(wěn)定性，本研究按照GB 6379.2《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分:確定標(biāo)準(zhǔn)測量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》的有關(guān)規(guī)定，對本研究測定葡萄酒水中δ18O的穩(wěn)定性進行對比分析，結(jié)果列于表3。

表3 葡萄酒水中δ18O的實驗室協(xié)同實驗Table 3 Repeatability and reproducibility of δ18O-value of water in wine

3 GasBench Ⅱ-IRMS 在葡萄酒摻水鑒別中的初步研究

為檢驗本方法在葡萄酒摻水鑒別中的應(yīng)用效果，選擇葡萄酒和蒸餾水為研究對象，并將葡萄酒與蒸餾水按照2∶8、4∶6、6∶4、8∶2比例進行配制，混勻，得到外源水摻入比例分別為0、20%、40%、60%、80%、100%的6個模擬樣品，并測定其水中δ18O，結(jié)果示于圖3a。各樣品的水中δ18O隨著外源水含量的增加而下降，且呈現(xiàn)良好的線性負相關(guān)關(guān)系(R2=0.998 8)，擬合方程為δ18O=-10.255x+1.028 3(x為外源水含量)。因此，針對該葡萄酒和外源水，可利用此關(guān)系檢測葡萄酒中是否摻水，并可進一步推斷外源水的含量。然而需要注意的是，擬合方程中的斜率與截距并非常數(shù)，會因原葡萄酒、外源水的水中δ18O不同而變化，結(jié)果示于圖3b。

圖3 葡萄酒水中δ18O與外源水含量的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation between δ18O of water in spiked wine and exogenous water content

4 結(jié)論

本研究建立了GasBench II-IRMS測定葡萄酒水中氧同位素組成的在線分析方法，實驗結(jié)果表明，反應(yīng)瓶在52 h內(nèi)不會出現(xiàn)同位素分餾，葡萄酒樣品體積及乙醇均不會影響測定結(jié)果，平衡24 h后可達到交換平衡，在24～48 h內(nèi)測定時的重復(fù)性與再現(xiàn)性結(jié)果均滿足實驗需求。相對于離線測定方法，該方法操作簡便、分析速度快，適合葡萄酒行業(yè)和質(zhì)檢系統(tǒng)的大規(guī)模樣品測定。

通過模擬實驗表明，葡萄酒水中δ18O與外源水含量線性相關(guān)，可用于葡萄酒中外源水含量的判別。

參考文獻：

[1] MARTINELLI L A, MOREIRA M Z, OMETTO J P, et al. Stable carbon isotopic composition of the wine and CO2bubbles of sparkling wines: Detecting C4 sugar additions[J]. J Agric Food Chem, 2003,51(9):2 625-2 631.

[2] GIMéNEZ-MIRALLES J E, SALAZAR D M, SO-LANA I. Regional origin assignment of red wines from valencia (spain) by2H NMR and13C IRMS stable isotope analysis of fermentative ethanol[J]. J Agric Food Chem, 1999, 47 (7):2 645-2 652.

[3] OGRINC N, KOSIR I J, KOCJANCIC M, et al. Determination of authenticity, regional origin, and vintage of Slovenian wines using a combination of IRMS and SNIF-NMR analyses[J]. J Agric Food Chem, 2001,49(3):1 432-1 440.

[4] ADAMI L, DUTRA S V, MARCON A R, et al. Geographic origin of southern Brazilian wines by carbon and oxygen isotope analyses[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2010,24(20):2 943-2 948.

[5] MAGDAS D A, CUNA S, CRISTEA G, et al. Stable isotopes determination in some Romanian wines[J]. Isotopes Environ Health Stud, 2012, 48(2):345-353.

[6] DRIVELOS S A, GEORGIOU C A. Multi-element and multi-isotope-ratio analysis to determine the geographical origin of foods in the European Union[J]. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2012, 40(2 012): 38-51.

[7] DUTRA S V, ADAMIA L, MARCON A R, et al.Characterization of wines according the geographical origin by analysis of isotopes and minerals and the influence of harvest on the isotope values[J]. Food Chemistry, 2013,143(3): 2 148-2 153.

[8] CHRISTOPH N, ROSSMANN A, SCHLICHT C,et al. Wine authentication using stable isotope ratio analysis: Significance of geographic origin, climate, and viticultural parameters[J]. ACS Symposium Series, 2006,952(11):166-179.

[9] CALDERONE G, GUILLOU C. Analysis of isotopic ratios for the detection of illegal watering of beverages[J]. Food Chemistry, 2008, 106(4):1 399-1 405.

[10] WEST J B, EHLERINGER J R, CERLING T E. Geography and vintage predicted by a novel GIS model of wine delta18O[J]. J Agric Food Chem, 2007,55(17):7 075-7 083.

[11] ROSSMANN A, RENIERO F, MOUSSA I, et al.Stable oxygen isotope content of water of EU data-bank wines from Italy, France and Germany[J]. Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und-Forschung A, 1999, 208(5/6):400-407.

[12] HERMANN A, VOERKELIUS S. Meteorological impact on oxygen isotope ratios of German wines[J]. Am J Enol, 2008, 59(2):194-199.

[13] Resolution OIV-Oeno 353/2009. Method OIV-MA-AS2-12 Method for18O/16O isotope ratio determination of water in wine and must[S]. Paris: International Office of Vine and Wine, 2010.

[14] PAUL D, SKRZYPEK G. Flushing time and st-orage effects on the accuracy and precision of carbon and oxygen isotope ratios of sample using the GasBench II technique[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2006, 20(13):2 033-2 040.

[15] 杜廣鵬,王 旭,張福松.GasBenchⅡ頂空瓶內(nèi)空氣背景對<100 μg碳酸鹽中碳氧同位素在線測定的影響及校正方法初探[J].巖礦測試, 2010, 29(6): 631-638.

DU Guangpeng, WANG Xu, ZHANG Fusong. Influence of the air background in GasBench II vials on the measurement of C and O isotopes in carbonates and a preliminary study on blank correction strategy[J]. Rock and Mineral Analysis, 2010, 29(6): 631-638(in Chinese).

[16] 孫 青,王曉華,石麗明,等.GasBench Ⅱ IRMS水平衡氫氧同位素分析方法研究[J]. 巖礦測試,2009, 28(1):1-4.

SUN Qing, WANG Xiaohua, SHI liming, et al. Determination of hydrogen and oxygen isotope ratios in water samples by GasBench II IRMS using aqua equilibration technique[J]. Rock and Mineral Analysis, 2009, 28(1):1-4 (in Chinese).

[17] 張 琳,陳宗宇,劉福亮,等.水中氫氧同位素不同分析方法的對比[J]. 巖礦測試, 2011, 30(4):160-163.

ZHANG Lin, CHEN Zongyu, LIU Fuliang, et al. Study on method for hydrogen and oxygen isotope analysis of water samples[J]. Rock and Mineral Analysis,2011,30(4):160-163(in Chinese).

[18] EPSTEIN S, MAYEDA T. Variation of18O content of waters from natural sources[J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 1953, 4(5): 213-224.

[19] NELSON S T. A Simple, practical methodology for routine VSMOW/SLAP normalization of water samples analyzed by continuous flow methods[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2000, 14(12): 1 044-1 046.

[20] 陶 成,張美珍,楊華敏, 等. GasBench II-IRMS水平衡氫同位素分析方法研究及應(yīng)用[J].質(zhì)譜學(xué)報,2006,27(4):215-219.

Tao Cheng, Zhang Meizhen, Yang Minhua, et al. The research and application of GasBench-IRMS H2/H2O(l) equlibrium H/ D isotope analysis[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2006,27(4):215-219(in Chinese).