宋丹丹，曹秀琴，沈佳偉，周瑋麗

(上海市閔行區(qū)吳涇醫(yī)院藥劑科，上海 200241)

鹽酸二甲雙胍(metformin hydrochloride, MET)是臨床上治療2型糖尿病最常用的藥物之一。它主要通過增加肌肉、脂肪等周圍組織對葡萄糖的攝取和利用來降低血糖，而非刺激胰島素分泌，從而可起到保護(hù)已受損的胰島B細(xì)胞的作用，有利于糖尿病的長期控制。目前報道的測定MET血漿濃度的HPLC法，存在靈敏度低[1]，使用柱轉(zhuǎn)換系統(tǒng)煩瑣[2]，樣品預(yù)處理過程復(fù)雜等不足之處。本研究建立一種測定小鼠血漿中MET濃度的反相離子對HPLC法，具有靈敏度高、方法簡單快速、樣品預(yù)處理過程簡便有效、洗脫時間合理等特點。應(yīng)用此方法可開展MET在小鼠體內(nèi)藥動學(xué)和生物利用度的研究。

1 儀器和材料

1.1 儀器 L-2000高效液相色譜儀(日本Hitachi公司)，含L-2130泵、L-2200自動進(jìn)樣器、L-2300柱溫箱、L-2400 UV檢測器、D-2000 Elite HPLC色譜工作站；LaChrom C18色譜柱(日立高新技術(shù)公司)；AL 104分析天平、FE20 Plus pH計(梅特勒-托利多公司)； Master-S超純水儀(上海和泰公司)。

1.2 藥品和試劑 鹽酸二甲雙胍對照品(純度100.0%，中國食品藥品檢定研究院，批號100664-200602)。甲醇(色譜純，德國默克公司)；高氯酸、磷酸二氫鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 動物 KM小鼠(上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司，合格證號2007000546508)，雄性，體重(25±2) g。動物常規(guī)飼養(yǎng)，實驗前夜禁食不禁水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 LaChrom C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液(含10 mmol/L SDS和10 mmol/L NaH2PO4，pH=5.2)-甲醇(40∶60)；流速：1.0 ml/min；柱溫30 ℃；檢測波長：233 nm。

2.2 儲備液、對照品及血漿樣品的準(zhǔn)備 精密稱取適量MET對照品置于25 ml容量瓶中，加甲醇溶解配成1000 μg/ml的MET對照品儲備液，4 ℃保存。小鼠經(jīng)眼球后靜脈叢取血，置于肝素化的EP管中，860×g離心10 min，取上層血漿置于-20 ℃保存。吸取MET對照品儲備液適量，用小鼠空白血漿稀釋制成質(zhì)量濃度為200 μg/ml的MET對照品溶液，再以空白血漿分別稀釋成0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/ml 7個標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。將0.5、2.0、8.0 μg/ml 3個濃度作為低、中、高濃度質(zhì)控樣品(QC)。所有制備的樣品包括QC在內(nèi)檢測前置于-20 ℃保存。

2.3 樣品預(yù)處理 取2.2項下制備的血漿樣品150 μl，加入30%高氯酸溶液9 μl置于離心管中，渦旋1 min混合均勻，13 680×g離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μl。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 特異性實驗 取小鼠空白血漿、含MET的血漿進(jìn)樣測定，得到色譜圖見圖1。從圖1可見，基線噪音較小，血漿中代謝物峰及其他內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾MET的測定，分離完全且峰形較好，MET的保留時間約為7.5 min。信噪比(S/N)≥3時檢測到的最低濃度為0.10 μg/ml。

圖1 鹽酸二甲雙胍的HPLC譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取2.2項下7個標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的MET對照品溶液按2.3項方法預(yù)處理，分別進(jìn)樣測定，以MET的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=220 050X-16 675 (r=0.999 1，n=5)，表明在0.2～16.0 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4.3 精密度實驗 取低、中、高濃度QC樣品，按血漿樣品的處理方法進(jìn)行操作，分別于1 d內(nèi)5個不同時間點測定一批QC樣品(每個濃度5份)，計算日內(nèi)精密度；另連續(xù)測定3 d，每天測定1批QC樣品， 計算日間精密度， 結(jié)果見表1。

表1 鹽酸二甲雙胍的精密度和回收率實驗結(jié)果

表1 鹽酸二甲雙胍的精密度和回收率實驗結(jié)果

濃度(ρB/μg·ml-1)日內(nèi)RSD日間RSD方法回收率提取回收率室溫放置穩(wěn)定性RSD反復(fù)凍融穩(wěn)定性RSD0．5 0．60 0．85106．56±0．5280．98±1．725．21 8．562．0 0．17 0．6597．09±0．1684．05±1．231．69 1．438．0 0．10 0．3890．50±0．1080．96±0．794．46 4．48

2.4.5 室溫放置穩(wěn)定性及血漿反復(fù)凍融穩(wěn)定性實驗 取低、中、高濃度QC血漿樣品各5份，按血漿樣品處理方法操作后，室溫放置，分別于0、12、24 h進(jìn)樣檢測，考察其制備后室溫放置穩(wěn)定性。血漿反復(fù)凍融穩(wěn)定性：取低、中、高濃度QC樣品各3批(每批低、中、高3個濃度各5份)，分別于第0、7、14天取出融化后測定一批，其余再次置于-20 ℃冷凍待下次檢測，結(jié)果見表1。

3 討 論

近年來有很多文獻(xiàn)報道了MET血藥濃度的測定方法，包括液質(zhì)聯(lián)用測定法(LC-MS/MS)[3-5]，液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用法[6]，及采用UV或DAD檢測的HPLC法。LC-MS/MS檢測盡管提高了敏感性，但由于其復(fù)雜的技術(shù)要求及高額成本，并不適用于多數(shù)實驗室檢測。HPLC具有高效、快速、進(jìn)樣量小、溶劑消耗少等特點，因此廣泛用于MET血藥濃度的測定。MET的堿性和極性都很強(qiáng)，采用常規(guī)RP-HPLC檢測難以獲得理想的保留時間。在優(yōu)化色譜條件時，依據(jù)文獻(xiàn)調(diào)整流動相組成[7,8]，采用甲醇-磷酸鹽緩沖溶液作為流動相，加入SDS與MET結(jié)合形成離子對，延長其在反相色譜柱中的保留時間。MET的紫外最大吸收波長為233 nm，而在此波長下血漿中的極性內(nèi)源性物質(zhì)會造成很大干擾。通過調(diào)節(jié)有機(jī)相與水相的比例以改變極性，最終確定流動相為磷酸鹽緩沖液(含10 mmol/L NaH2PO4和10 mmol/L SDS，pH 5.2)-甲醇(40∶60)，在此條件下MET保留時間為7.5 min，保留時間適中，既能避免血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)(保留時間2～4 min)的干擾，又不會因保留時間過長而延誤實驗時間、浪費(fèi)溶劑。

在血漿樣品處理過程中，MET與血漿結(jié)合率較低，但其極性較大，難以從血漿中萃取出來。Chen等[9]采用200 μl血漿中加入50 μl 10%高氯酸溶液沉淀蛋白質(zhì)，渦旋離心后直接取上清液上樣。本研究在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對比沉淀劑、加入的量及渦旋時間，最終采用150 μl血漿中加入9 μl 30%高氯酸渦旋混合1 min，無需添加甲醇或乙腈等蛋白質(zhì)沉淀劑，即可將血漿蛋白質(zhì)沉淀完全，亦無干擾峰出現(xiàn)。以該方法直接沉淀蛋白質(zhì)進(jìn)行血漿樣品處理，比萃取法更簡單、快速，適用于大樣本血藥濃度檢測。

綜上所述，本研究從實際條件出發(fā)，建立了線性關(guān)系良好、精密度與穩(wěn)定性符合定量分析要求、靈敏度高、重現(xiàn)性好、簡便經(jīng)濟(jì)的小鼠血漿中MET的含量測定方法，為臨床進(jìn)一步開展藥動學(xué)研究提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

致謝本研究得到復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院盧建忠教授的大力支持和幫助，在此致以衷心的感謝！

【參考文獻(xiàn)】

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