豆甲泰,李勝文 (解放軍209醫(yī)院藥械科，黑龍江 牡丹江 157011)

葫蘆素片臨床上主要用于濕熱毒盛所致遷延性肝炎、慢性肝炎及原發(fā)性肝癌的輔助治療。其主要成分是從葫蘆科植物甜瓜瓜蒂中提取出的葫蘆素B，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)葫蘆素B抗癌機(jī)制的研究可歸納為：葫蘆素B分子結(jié)構(gòu)側(cè)鏈上帶有的不飽和羰基，是高度親電子中心的親核基團(tuán)，可使控制細(xì)胞分裂的酶烷化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。據(jù)研究其還具有細(xì)胞毒性、保肝、提高機(jī)體免疫力和抗炎活性等多種作用[1-3]。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法，對(duì)葫蘆素片中葫蘆素B的含量進(jìn)行測(cè)定，方法簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

1 儀器和試藥

Aglilent-1100高效液相色譜系統(tǒng)包括四元泵，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器，Aglilent-1100色譜工作站。實(shí)驗(yàn)用超純水由Milli-Q超純水器制備系統(tǒng) (Millipore Corporation, MA,U.S.A.)提供。葫蘆素片(批號(hào):080301、080601、080901、090101、090102、090601、090602、090701、091001、091002，浙江普洛康裕天然藥物有限公司)，葫蘆素B標(biāo)準(zhǔn)品(自制,純度>98.5%)。乙腈、甲醇(色譜純，Merck公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm, )；流動(dòng)相：乙腈-水=(51:49)；流速: 1.0 ml/min；進(jìn)樣體積：4 μl；柱溫：25 ℃。葫蘆素B標(biāo)準(zhǔn)品及供試品色譜圖,見圖1。

2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葫蘆素B標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入無(wú)水甲醇適量制成1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上述溶液通過(guò)微孔濾膜后，放入4 ℃冰箱中備用。

2.3供試品溶液的制備 取葫蘆素片18片，精密稱定，研細(xì)，取細(xì)粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇30 ml，超聲振搖30 min，放置10 min，濾過(guò)，用少量甲醇洗滌，洗液并入同一量杯中，并用甲醇定容為30 ml，搖勻，即得。取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，4℃保存，供進(jìn)樣分析用。

2.4線性關(guān)系考察 準(zhǔn)確配制葫蘆素B對(duì)照品的甲醇溶液，濃度為1 mg/ml，自動(dòng)進(jìn)樣量分別設(shè)為0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μl測(cè)出葫蘆素B的峰面積，同時(shí)以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=1 067.3C-0.508 4,r=1,n=7;結(jié)果表明葫蘆素B在進(jìn)樣量為0.1～16 μg時(shí)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 葫蘆素B高效液相色譜圖

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣4 μl，再以上述色譜條件和檢測(cè)方法下測(cè)定對(duì)照品的峰面積，RSD=0197%，說(shuō)明本法精密度較好,結(jié)果見表1。

表1 葫蘆素片精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取葫蘆素片粉末(批號(hào)：090602，浙江普洛康裕天然藥物有限公司)，6份每份0.2 g，精密稱定。按“2.3”項(xiàng)下制備，并在上述色譜條件和檢測(cè)方法下測(cè)定，記錄色譜峰的峰面積，計(jì)算出每0.2 g葫蘆素片中葫蘆素B的平均含量為0.190 3 mg，計(jì)算葫蘆素B含量的RSD=3.87%,說(shuō)明本法重復(fù)性較好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取葫蘆素片粉末(生產(chǎn)廠家：浙江普洛康裕天然藥物有限公司；批號(hào)：090602)，按照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別在樣品制備并于室溫(25 ℃)放置0、2、6、10、16、24 h后在上述色譜條件和檢測(cè)方法下測(cè)定，記錄色譜峰的峰面積，計(jì)算峰面積RSD=1.27%,說(shuō)明供試品溶液中各目標(biāo)成分至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定，滿足樣品測(cè)定的要求。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取葫蘆素片粉末(批號(hào)：090602，浙江普洛康裕天然藥物有限公司)，6份0.2 g，精密加入對(duì)照品適量，按照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，在上述色譜條件和檢測(cè)方法下進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜峰的峰面積，計(jì)算葫蘆素B含量?；厥章?(測(cè)得葫蘆素B的含量-葫蘆素片中葫蘆素B的含量)/對(duì)照品加入量×100%。加樣回收率和RSD值見表2。結(jié)果表明，葫蘆素B的平均回收率為99.39% ，RSD為0.48 %，說(shuō)明回收率較高。

表2 葫蘆素片加樣回收率試實(shí)結(jié)果(n=6)

2.9樣品含量測(cè)定 取同一廠家(浙江普洛康裕天然藥物有限公司)生產(chǎn)的6個(gè)不同批號(hào)的葫蘆素片樣品。按照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，在上述色譜條件和檢測(cè)方法下進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜峰的峰面積，計(jì)算各批次葫蘆素片中葫蘆素B的含量，每批測(cè)3次，取平均值(表3)。結(jié)果表明：6個(gè)批次中的葫蘆素片中葫蘆素B含量最低為0.076 7%，符合葫蘆素B 0.06 mg/片的要求，所測(cè)6批樣品均合格。

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)試用不同配比的乙腈-水系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，最終發(fā)現(xiàn)以流動(dòng)相乙腈∶水(51∶49)系統(tǒng)為佳，各色譜峰的分離度較好，保留時(shí)間適中。

3.2提取溶劑、方法及時(shí)間的優(yōu)化 筆者采用超聲波提取法，以甲醇為提取溶劑，先后采用甲醇8、12、20 ml；提取時(shí)間20、30、50 min；最終確定甲醇12 ml，提取30 min效果最佳。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=6)

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 對(duì)葫蘆素B進(jìn)行UV測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在228 nm處有最大吸收，故選擇228 nm作為含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)[4-10]。

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