張改云, 范 林, 侯忠海，張玉便，楊艷柳 (.國(guó)家海洋局第三海洋研究所生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 36005；.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 060)

糖尿病是以持續(xù)高血糖為基本生化特征的一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病。目前臨床上常用的口服降血糖藥物主要有硫脲類(lèi)、雙胍類(lèi)、噻唑烷二酮類(lèi)、非磺脲類(lèi)ATP敏感性鉀通道抑制劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑等。臨床上使用的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要為阿卡波糖和伏格列波糖。近年來(lái)，天然產(chǎn)物來(lái)源的抑制葡萄糖苷酶的研究已成為糖尿病治療藥物研究的熱點(diǎn)之一[1]。海星是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、價(jià)值極高的海洋動(dòng)物，不僅能食用和飼用，而且可以藥用，具有一定的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值及良好的開(kāi)發(fā)利用前景。現(xiàn)代藥理研究表明，海星具有抗癌、抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌、溶血、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降壓、抗炎等活性[2]。筆者采用小鼠口服糖耐量試驗(yàn)結(jié)合體外α-葡萄糖苷酶-抑制劑模型研究了4種海星對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用及其活性部位。

1 材料

1.1儀器與試劑 對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG，Sigma公司)、阿卡波糖(acarbose，拜耳醫(yī)藥保健有限公司)、四氧嘧啶(USA，Sigma公司)、葡萄糖測(cè)定試劑盒(北京普利來(lái)生物制品有限公司)、血糖儀(EZ Smart型，臺(tái)灣臺(tái)欣公司)、血糖試紙(EZ Smart血糖測(cè)試片)。

1.2藥物 海星樣品：4種海星均購(gòu)自廈門(mén)市第八海鮮市場(chǎng)，由國(guó)家海洋局第三海洋研究所生態(tài)室王建軍博士分別鑒定為：羅氏海盤(pán)車(chē)(AsteriasrollestoniBell)、飛白楓海星(Archastertypicus)、騎士章海星(StellasterequestrisRetzius)和中華疣海星(Pentacerasterchinensis)。

1.3動(dòng)物 清潔級(jí)ICR小鼠，18～22 g，雄性，購(gòu)自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。飼養(yǎng)條件：動(dòng)物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，小鼠每籠放養(yǎng)10只，飼養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)，由專(zhuān)人飼養(yǎng)管理。動(dòng)物室光照充足，通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備良好，室溫控制在20～25 ℃，相對(duì)濕度為60%～70%。實(shí)驗(yàn)室按常規(guī)定期消毒。

2 方法

2.1海星提取方法 將4種海星各100 g用剪刀剪碎，分別加入70%的乙醇200 ml，超聲提取3次，每次30 min，合并濾液，減壓濃縮蒸干即得海星的粗提物。

2.2α-葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作 用磷酸緩沖液配制1 000 mol/L pNPG，并稀釋成100、70、45、15、10、5、1 mol/L。分別取上述7種不同濃度的pNPG溶液各100 ml，加入100 μl，500 U/L α-葡糖苷酶，置于37 ℃恒溫水浴箱25 min；然后加入0.2 μmol/L NaOH溶液100 ml，混勻，在405 nm下測(cè)定消光度OD值，測(cè)3組，取平均值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，對(duì)硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.3測(cè)定α-葡萄糖苷酶活力 在112 μl磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)中加入200 U/L α-葡萄糖苷酶20 μl、DMSO 8 μl，置于37 ℃恒溫水浴箱15 min后加入2.5 mmol/L pNPG 20 μl，搖勻，37 ℃溫育15 min，再加入0.2 mol/L Na2CO3溶液80 μl，于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。

2.4測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制率 葡萄糖苷酶10 μl，加入樣品液20 μl(各藥物的終濃度為1 mg/ml)，于37 ℃恒溫水浴箱溫育15 min；然后加入70 μl pNPG溶液，于37℃水浴反應(yīng)25 min；再加入70 μl，0.15 mol/L的NaOH溶液終止反應(yīng)，放入37 ℃恒溫水浴箱顯色15 min。在405 nm處測(cè)定吸光度(An)。以PBS溶液代替酶液作為陰性對(duì)照(A1)；以PBS溶液代替樣品液作為空白對(duì)照(Ao)；1 mg/ml的阿卡波糖溶液代替樣品液作為陽(yáng)性對(duì)照。葡萄糖苷酶的抑制率(I)= [Ao- (An-A1)]/Ao×100%。

2.5高血糖小鼠口服糖耐量試驗(yàn) 取ICR小鼠60只，造模前禁食16 h，飲水不限。四氧嘧啶用蒸餾水新鮮配制成濃度為6 mg/ml的溶液，以60 mg/kg(0.2 ml/20 g，iv)造模。48 h后血糖儀測(cè)量血糖值，取血糖值不低于14.5 mmol/L者用于實(shí)驗(yàn)。模型動(dòng)物60只隨機(jī)分成6組，每組10只，即模型對(duì)照組、阿卡波糖組、4種海星粗提物組(相當(dāng)于海星10 g/kg，iv)；另取10只正常小鼠為空白組。

所有小鼠禁食12 h，給予灌胃藥物(受試藥陽(yáng)性阿卡波糖，對(duì)照生理鹽水)30 min后，麥芽糖按2.5 g/kg體重的劑量灌胃，分別在0、45、90 min從尾靜脈采血，檢測(cè)血糖變化。

2.6正常小鼠口服糖耐量試驗(yàn) 取ICR小鼠60只，按體重隨機(jī)分成6組，即空白組、阿卡波糖組，4種海星粗提物組(相當(dāng)于海星10 g/kg，iv)，每組10只。所有小鼠禁食12 h，給予灌胃藥物(受試藥陽(yáng)性阿卡波糖，對(duì)照生理鹽水)30 min后，麥芽糖按2.5 g/kg體重的劑量灌胃，分別在0、45、90 min從尾靜脈采血，檢測(cè)血糖變化。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1α-葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 如圖1所示，α-葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=0.005X+0.044，r=0.999 5，其線(xiàn)性良好。

圖1 α-葡萄糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

3.2海星提取物對(duì)正常小鼠口服糖耐量的影響 正常小鼠給予麥芽糖后，各組小鼠血糖均升高，30 min后血糖持續(xù)恢復(fù)；與0 min比較，30、60 min時(shí)血糖升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與0 min比較，陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖組和羅氏海盤(pán)車(chē)粗提物組在30、60、120 min血糖升高不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明其對(duì)正常小鼠口服麥芽糖后血糖升高有一定抑制作用。而飛白楓海星、騎士章海星和中華疣海星粗提物則無(wú)顯著改善正常小鼠口服糖耐量作用(表1)。

表1 4種海星提取物對(duì)正常小鼠糖耐量的影響

1)P< 0.05，2)P< 0.01，與0 min比較

3.34種海星提取物對(duì)高血糖小鼠口服糖耐量的影響 正常小鼠和高血糖小鼠灌胃麥芽糖后各組小鼠血糖均升高，0.5 h小鼠血糖均達(dá)到最高值，然后逐漸降低。陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖組和羅氏海盤(pán)車(chē)粗提物組對(duì)四氧嘧啶性高血糖小鼠的糖耐量有明顯改善作用(表2)。

表2 海星提取物對(duì)高血糖小鼠糖耐量的影響

1)P< 0.05，2)P< 0.01，與模型組比較

3.4羅氏海盤(pán)車(chē)粗提物中不同活性部位對(duì)α-葡萄糖苷酶的作用 筆者進(jìn)一步對(duì)羅氏海盤(pán)車(chē)的粗提物用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取，得到4個(gè)相應(yīng)的萃取物，活性結(jié)果表明，其中正丁醇部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，濃度為1 mg/ml時(shí)抑制率為89.6 %；其次為乙酸乙酯部分，抑制率為60.2%，而石油醚和氯仿部分則活性較弱(表3)。

表3 羅氏海盤(pán)車(chē)不同提取部位與阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶影響的比較

4 討論

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)又稱(chēng)葡萄糖苷水解酶、麥芽糖酶，位于小腸刷狀緣膜上皮細(xì)胞,能將雙糖如蔗糖、麥芽糖等水解成可被小腸吸收的單糖，是食物中糖(碳水化合物)水解的關(guān)鍵酶。因此，α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用機(jī)制是抑制糖在小腸上部的吸收，減少葡萄糖吸收入血，進(jìn)而抑制餐后高血糖，改善對(duì)血糖的控制，降低餐后血糖升高的幅度，可減輕對(duì)胰島B細(xì)胞的刺激，從而使血漿胰島素分泌減少，起到緩解胰島B細(xì)胞負(fù)荷的作用[3]。1995年，阿卡波糖(拜糖平，acarbose)被FDA批準(zhǔn)用于臨床，在2型糖尿病的治療中發(fā)揮重要作用，但有一定的副作用。因此，有必要繼續(xù)研發(fā)副作用小、療效可靠的α-葡萄糖苷酶抑制劑。海星含有大量結(jié)構(gòu)獨(dú)特的具有生物活性的代謝產(chǎn)物，如皂苷、生物堿、甾醇、多糖、維生素、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸等，它們具有抗癌、抑菌、抗病毒、抗炎、降血壓、降血糖和降血脂等活性[4]。許東暉等[5]研究發(fā)現(xiàn)從多棘海盤(pán)車(chē)中分離并經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾獲得的海星甾醇A1998可明顯降低四氧嘧啶及鏈脲霉素誘導(dǎo)的小鼠糖尿病模型的血糖含量，其機(jī)制與增強(qiáng)胰島細(xì)胞對(duì)葡萄糖反應(yīng)的敏感性有關(guān)。筆者研究了4種海星的降血糖作用并發(fā)現(xiàn)抑制α-葡萄糖苷酶的活性部位。

四氧嘧啶是一種特異性細(xì)胞毒性物質(zhì)，可選擇性損傷動(dòng)物胰島B細(xì)胞，促進(jìn)氧自由基釋放，直接破壞B細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，損傷DNA，使胰島素合成障礙，空腹血糖升高。筆者采用四氧嘧啶造糖尿病小鼠模型，首先通過(guò)正常小鼠和糖尿病小鼠口服糖耐量試驗(yàn)[6,7]比較研究了4種海星的乙醇提取物改善口服糖耐量的作用，發(fā)現(xiàn)羅氏海盤(pán)車(chē)的乙醇提取物具有顯著改善正常小鼠和糖尿病小鼠口服糖耐量的作用，提示羅氏海盤(pán)車(chē)的乙醇提取物可能通過(guò)增加胰島素分泌，提高胰島素敏感性或抑制α-葡萄糖苷酶起到降低餐后血糖的作用。由于羅氏海盤(pán)車(chē)的乙醇提取物不增加胰島素分泌和胰島素敏感性，而是具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，減少麥芽糖水解為單糖，進(jìn)而抑制餐后高血糖。筆者進(jìn)一步建立體外α-葡萄糖苷酶抑制劑模型[8,9]，確定羅氏海盤(pán)車(chē)粗提物中抑制α-葡萄糖苷酶的活性部位,發(fā)現(xiàn)正丁醇萃取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，其次為乙酸乙酯部位。羅氏海盤(pán)車(chē)屬海星綱(Asteroidea)鉗棘目(Forcipulatida)海盤(pán)車(chē)科(Asteriidae)動(dòng)物，資源豐富，在我國(guó)黃海有大量分布。在民間，羅氏海盤(pán)車(chē)常被用來(lái)預(yù)防或治療胃潰瘍、補(bǔ)腎壯陽(yáng)等，具有較高的藥用價(jià)值，文獻(xiàn)報(bào)道了羅氏海盤(pán)車(chē)中含有微量元素、氨基酸、皂苷和腺苷等[10]。筆者發(fā)現(xiàn)其大極性的正丁醇部位和中等極性的乙酸乙酯部位具有較好的抑制α-葡萄糖苷酶活性，拓寬了其應(yīng)用價(jià)值，但其具體的降糖活性成分尚有待進(jìn)一步的研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 袁 鑫, 耿 越. 海星生物活性成分的研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2011, 23(B12): 268-271.

[2] 劉鐵錚, 郭愛(ài)潔, 王桂春, 等. 海星化學(xué)成分的生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 38(13): 122-125.

[3] Lee SM. The effect of chronic alpha-glucosidase inhibition on diabetic nephropathy in the Db/Db mouse[J]. Diabetes, 1982, 31 (3): 249-254.

[4] 黃宗國(guó)．中國(guó)海洋生物種類(lèi)與分布[M]. 北京: 海洋出版社, 1990, 705-708.

[5] 許東暉, 許實(shí)波．海洋新化合物A1998降血糖作用機(jī)制研究[J]. 中草藥，1999, 30 (10): 752-755.

[6] 韋寶偉, 劉布鳴, 曾憲彪, 等. 木姜葉柯總黃酮對(duì)大小鼠血糖和糖耐量的影響[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2012, 27 (1): 19-22.

[7] 何 敏, 吳 鋒, 徐濟(jì)良. 靈芝多糖對(duì)小鼠糖耐量的影響 [J]. 南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 24 (4): 369-372.

[8] 楊 倩, 張 茜, 張德甫, 等. 11味中藥提取物中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2011, 22 (12): 3011-3012.

[9] Si MM, Lou JS, Zhou CX,etal. Insulin releasing and alpha-glucosidase inhibitory activity of ethyl acetate fraction ofAcoruscalamusinvitroandinvivo[J]. J Ethnopharmacol, 2010, 128(1): 154-159.

[10] 劉 濤, 詹永成, 裴月湖. 羅氏海盤(pán)車(chē)中一個(gè)新的腦苷脂類(lèi)化合物羅氏腦苷[D]. 中國(guó)天然藥物, 2007, 5 (3): 179-181.