何 進(jìn)，任 雪，曹家輔，安 曄，劉瑞霞(.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，遼寧 沈陽006；. 沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽006)

水調(diào)散是沈陽軍區(qū)總醫(yī)院研制的制劑，是一種由黃柏、煅(石膏)為主要藥味的外用散劑，具有清熱解毒、消腫止痛的作用，用于未潰破的瘡癤疔毒。按照《中華人民共和國藥典(一部)》2010版附錄相關(guān)規(guī)定[1]進(jìn)行微生物限度檢查，因許多藥品本身具有抑菌性，對微生物的檢測有干擾，因此在確定藥品微生物限度檢查方法時必須進(jìn)行方法學(xué)驗證，以確保在實際檢驗條件下藥品微生物檢測方法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性[2，3]。本實驗對水調(diào)散的微生物限度檢查方法進(jìn)行了驗證，為建立該制劑微生物限度檢查方法提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1藥品和培養(yǎng)基 水調(diào)散(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，批號：20110107、20110210、20110321)；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：110316)，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號：091008)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號：110224)，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號：100426)，膽鹽乳糖(BL)培養(yǎng)基(批號：090517)，蛋白胨(批號：090712)，以上產(chǎn)品均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.2菌株 大腸桿菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(B)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(B)98003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]，均為第3代菌株，購自遼寧省藥檢所。

1.3儀器 ZF-Ⅰ型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；NC303-4A電熱恒溫培養(yǎng)箱和NC303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱(南京長江儀器廠)；YX280B手提式不銹鋼消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液的制備 取磷酸二氫鉀3.56 g、磷酸氫二鈉7.23 g、氯化鈉4.30 g、蛋白胨1.0 g，加水1 000 ml，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。

2.2供試液的制備 取水調(diào)散10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，在45℃恒溫水浴中保溫震蕩混勻，500 r/min離心3 min, 取其上清液作為1:10的供試液。

2.3菌液制備 分別取經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物，以及經(jīng)25℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋成每1 ml含菌數(shù)50～100 CFU的菌懸液；取經(jīng)25℃培養(yǎng)5 d的黑曲霉新鮮培養(yǎng)物，遞增稀釋成每1 ml含孢子數(shù)50～100 CFU的孢子懸液。以上各菌懸液或孢子懸液同時各取2份注入瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用平皿計數(shù)法計數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 微生物限度檢查活菌計數(shù)結(jié)果

2.4細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.4.1驗證方法與結(jié)果 實驗組：采用平皿法，取1:10供試液及50～100 CFU/ml實驗菌各1 ml，加入平皿中，立即傾注相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基20 ml，每株實驗菌平行制備2個平皿，待凝固后，按規(guī)定溫度培養(yǎng)48～72 h，按菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)，進(jìn)行3次獨立的平行實驗，并分別計算實驗組和稀釋劑對照組的菌回收率。依據(jù)《中華人民共和國藥典(一部)》2010版附錄微生物限度檢查方法[2]進(jìn)行判定，結(jié)果見表2。

表2 細(xì)菌、真菌和酵母菌計數(shù)方法回收率結(jié)果(n=3，%)

菌液組：測定所加的實驗菌數(shù)。

供試品對照組：取規(guī)定量1:10供試液，按菌落計數(shù)方法測定樣品本底菌數(shù)。結(jié)果均未見菌生長。

稀釋劑對照組：取稀釋液1 ml，同實驗組方法測定菌數(shù)。結(jié)果5種實驗菌回收率均>70%。

2.4.2樣品細(xì)菌、真菌或酵母菌計數(shù)檢查 取3批樣品各10 g，按“2.2”項下方法制成1:10的溶液。取1:10溶液10 ml，用pH 7.0無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液按10倍遞增稀釋法依次制成1:100，1:1 000，1:10 000的供試液。取3批樣品的上述3種濃度供試液各1 ml分別加入平皿中，然后傾入20 ml冷至45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌計數(shù))，另取1:10和1:100供試液各1 ml分別加入平皿中，傾入20 ml冷至45℃的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(真菌、酵母菌計數(shù))，混勻，凝固后倒置于特定溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間為3 d；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)時間為5 d)。每個稀釋級的供試液平行制備2份；另取稀釋液1 ml作陰性對照。結(jié)果表明，3批樣品按驗證方法檢查，細(xì)菌、真菌或酵母菌總數(shù)均<10 CFU/ml，符合規(guī)定。

2.5控制菌檢查方法的驗證

2.5.1菌種選擇 按照《中華人民共和國藥典(一部)》2010版附錄微生物限度檢查法[4]中的有關(guān)控制菌檢查方法，水調(diào)散應(yīng)檢查金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。

2.5.2菌液和供試液的制備 菌液按“2.3”項下方法制備，菌數(shù)控制在10～100 CFU/ml。供試液按本文“2.2”項下方法制備。

2.5.3驗證方法與結(jié)果 取100 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基6份， 2份分別加入10 ml供試液(1:10)及1ml 10～100 CFU/ml金黃色葡萄球菌作為實驗組，2份分別加入1 ml 10～100 CFU/ml金黃色葡萄球菌作為陽性對照組，2份分別加入稀釋劑10 ml 作為陰性對照組，均在30～35℃培養(yǎng)24 h。取上述各增菌培養(yǎng)物，用接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，35℃培養(yǎng)24 h。另取100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基6份，其中：2份分別加入10 ml供試液(1:10)及1 ml 10～100 CFU/ml銅綠假單胞菌懸液作為實驗組；2份分別加入1 ml 10～100 CFU/ml銅綠假單胞菌懸液作為陽

性對照組；2份分別加入稀釋劑10 ml 作為陰性對照組。上述各組均在30～35℃培養(yǎng)24 h。取上述各增菌培養(yǎng)物，用接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線接種至溴化十六烷基三甲基銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，35℃培養(yǎng)24 h。依據(jù)上述檢查方法進(jìn)行判定， 結(jié)果顯示，實驗組和陽性對照組控制菌生長良好，陰性對照組未檢出。詳見表3。

表3 檢查控制菌的結(jié)果

2.5.4樣品控制菌檢查 取3批樣品1:10的供試液各10 ml，分別接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基100 ml中；另取金黃色葡萄球菌的10～100 CFU/ml菌懸液1 ml、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 ml分別接種至同樣培養(yǎng)基中作為陽性對照和陰性對照。另取3批樣品1:10的供試液各10 ml，分別接種至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 ml中；取銅綠假單胞菌的10～100 CFU/ml菌懸液1 ml、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 ml分別接種至同樣培養(yǎng)基中作為陽性對照和陰性對照。3批樣品按驗證方法檢查,供試品組及陰性對照組均未見細(xì)菌生長，結(jié)果符合規(guī)定(表4)。

表4 樣品控制菌檢查結(jié)果

3 討論

在對藥品進(jìn)行微生物限度檢查方法驗證時，采用預(yù)實驗方法對驗證用菌株抑菌活性的強弱進(jìn)行預(yù)測，為正式實驗提供依據(jù)，同時減少工作量及試藥、試劑的浪費，提高工作效率。根據(jù)《中華人民共和國藥典(一部)》微生物限度檢查方法的規(guī)定,含抑菌成分的制劑, 必須消除供試液的抑菌活性, 然后再進(jìn)行微生物限度檢查。預(yù)實驗結(jié)果表明，水調(diào)散有抑菌作用，且由于該制劑是由原藥材細(xì)粉制成的散劑，制成供試液時存在大量的不溶性顆粒，采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌、真菌和酵母菌計數(shù)檢查及控制菌檢查時，對結(jié)果判斷有干擾。而采用離心沉淀法時，既能消除本品在檢查條件下的抑菌作用，又可排除對菌落計數(shù)的干擾，使污染的微生物順利檢出。

微生物限度檢查方法驗證為活菌計數(shù)實驗，其實驗方法受菌懸液濃度、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、實驗操作等諸多因素影響[5]。每次驗證實驗應(yīng)盡量平行，以保證實驗的可重復(fù)性，且日常檢驗方法應(yīng)與驗證方法保持一致，以保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

微生物的污染、生長和繁殖是影響中藥制劑質(zhì)量的重要因素，也是中藥制劑生產(chǎn)過程中比較突出的問題。尤其是中藥原粉入藥的散劑，從藥材清洗、干燥、粉碎到制劑成形工藝過程，每一環(huán)節(jié)都有可能染菌。因此，為了保證中藥制劑質(zhì)量，使制劑中不含或少含微生物，必須控制中藥制劑生產(chǎn)整個環(huán)節(jié)中的微生物限度，嚴(yán)格執(zhí)行符合《中華人民共和國藥典(一部)》的相關(guān)規(guī)定。

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