呂 磊，趙 亮，蘭紅濤，金柔男，張國慶 (第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院，上海 200438)

膽汁酸是膽汁的主要脂質(zhì)成分，在脂肪代謝中起重要作用，按結(jié)構(gòu)可分為游離型膽汁酸和結(jié)合型膽汁酸[1]。膽汁酸與肝膽系統(tǒng)疾病以及能引起膽汁酸代謝變化的其他疾病關(guān)系密切，不同病程患者的膽汁酸變化趨勢和程度均不同。因此，血清膽汁酸水平是衡量肝膽功能正常與否的重要指標(biāo)[2,3]。臨床上對膽汁酸的測定多為血清總膽汁酸，對肝膽系統(tǒng)疾病診斷特異性較低，而全面了解血清膽汁酸質(zhì)和量的變化無疑對肝膽疾病早期診斷和分度具有重要意義[4,5]。高效液相色譜[6]、氣相色譜[7]、毛細(xì)管電泳[8]等方法都曾應(yīng)用于膽汁酸的定量檢測，在檢測靈敏度、測定速度和樣品通量上均無法和質(zhì)譜法相比擬，未能應(yīng)用于臨床。高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的定量分析技術(shù)，由于具有高選擇性、高靈敏度的特點(diǎn)，逐漸成為生物樣品檢測的首選方法。近幾年，對體內(nèi)膽汁酸含量測定的研究者多采用LC-MS/MS法[9-12]，其結(jié)果對臨床有一定指導(dǎo)意義，未見對健康受試者和肝癌患者血漿膽汁酸含量對比的報(bào)道。本研究建立了HPLC-MS同時(shí)檢測健康人和原發(fā)性肝癌患者血漿中13種膽汁酸的方法，擬通過兩組對象體內(nèi)膽汁酸組分的含量對比分析，探索膽汁酸在肝癌患者體內(nèi)的代謝機(jī)制和分布差異，為肝膽疾病的臨床診斷提供借鑒。

1 儀器和試藥

1.1儀器 安捷倫1100高效液相色譜串聯(lián)1946D單四級桿質(zhì)譜(美國安捷倫公司)；配有ESI源及Chemstation工作站。XW-80A型渦旋混合器(上海琪特分析儀器有限公司)，TGL-16G型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)，METTLER AE240十萬分之一電子天平(德國梅特勒公司)。

1.2藥品和試劑 13種膽汁酸對照品詳見表1，均由詩丹德生物技術(shù)有限公司提供(純度>99%)，內(nèi)標(biāo)紅霉素購自中國藥品生物制品檢定所(批號：130307-200916)。甲酸、氨水、乙腈均為色譜純，購自Fisher公司，水為純化水。

2 方法和結(jié)果

2.1分析條件

2.1.1色譜條件 色譜柱:SHISEIDO MG C18(100 mm×3.0 mm，3.0 μm)，流動(dòng)相:A乙腈-B水(含0.1%甲酸和0.5%氨水)，梯度洗脫，A相比例隨時(shí)間的變化:30%～40%(0～4 min)，40%～80%(4～8 min)，80%(8～12 min)；流速: 0.4 ml/min，進(jìn)樣時(shí)間12 min，平衡時(shí)間5 min, 柱溫:25℃，進(jìn)樣量:5 μl。

2.1.2質(zhì)譜條件 采用ESI源負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓3 000 V，干燥氣流速10 L/min，霧化氣壓力45 psi，干燥氣溫度350℃。選擇離子模式(SIM)，分段監(jiān)測，碎片電壓200 V，13種膽汁酸的監(jiān)測離子均為[M-H]-，內(nèi)標(biāo)的監(jiān)測離子為[M+Cl]-。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)及其保留時(shí)間見表1。

2.2溶液的配制

2.2.113種膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取13種膽汁酸對照品，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得13種對照品儲(chǔ)備液。分別取適量單個(gè)對照品儲(chǔ)備液混合加入50 ml容量瓶中，用甲醇定容，即得混合對照品儲(chǔ)備液。按照1比1、2、4、10、20、40、100、200的比例逐級稀釋，即得8個(gè)濃度混合對照品系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱保存待用。

2.2.2內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取紅霉素對照品6.5 mg，置于50 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得130 μg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。取該儲(chǔ)備液0.5 ml置于50 ml量瓶中，加入乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得1.3 μg/ml紅霉素乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱保存待用。

表1 13種膽汁酸的優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間

2.3樣本收集 采集第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院2012年1月—6月收治的原發(fā)性肝癌患者血液標(biāo)本50例，門診健康體檢人群血液標(biāo)本20例。標(biāo)本采集人群的性別、年齡經(jīng)χ2檢驗(yàn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。50例原發(fā)性肝癌患者診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國肝癌診療指南》(2009版)，20例健康者均無高血脂、高血壓、糖尿病等病史，經(jīng)體檢和實(shí)驗(yàn)室檢測證實(shí)其心、肝、腎和胰功能正常，實(shí)驗(yàn)前未服用任何藥物，符合全國臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)對健康人群標(biāo)準(zhǔn)。血液標(biāo)本均采集于入院未經(jīng)任何治療時(shí)，清晨抽取空腹血4 ml，3 000 r/min離心10 min，分裝于-80℃冰箱保存至實(shí)驗(yàn)分析。

2.4血漿樣品前處理 血漿樣品經(jīng)室溫解凍后，精密量取200 μl，置1.5 ml離心管中，加入400 μl紅霉素乙腈溶液(1.3 μg/ml)，渦旋30 s，12 000 r/min離心3 min；取500 μl上清液，在40℃氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μl 30%乙腈溶解，渦旋離心，吸取上清液80 μl于進(jìn)樣瓶中，取5 μl進(jìn)樣分析。

2.5血漿樣品分析方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 膽汁酸屬內(nèi)源性物質(zhì)，血漿中含有一定量的膽汁酸，故須選擇低本底值的血漿樣品作為空白對照。取空白血漿 200 μl，精密加入系列膽汁酸混標(biāo)溶液50 μl，旋渦混勻，配成8個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)膽汁酸含藥血漿，按“2.4” 項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算各膽汁酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。以添加濃度(X)為橫坐標(biāo)，各膽汁酸扣除空白后的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，得回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 13種膽汁酸的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.5.2定量限與檢測限 經(jīng)逐級稀釋，分別按S/N>10和S/N>3測得13種膽汁酸的定量下限(LLOQ)分別為9.0、9.9、6.5、7.0、6.6、6.8、9.0、7.8、5.3、5.1、4.5、8.0和5.0 ng/ml；檢測限(LLOD)分別為3.0、3.3、2.2、2.3、2.2、2.3、3.0、2.6、1.8、1.7、1.5、2.7和1.7 ng/ml。

2.5.3精密度試驗(yàn) 制備低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿(相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的第2、5、7個(gè)濃度點(diǎn))，每個(gè)濃度各5份，按本文“2.4”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析。并于每天配制低、中、高濃度血漿樣本各5份，按本文“2.4”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析，連續(xù)測定3 d，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果13種膽汁酸的日內(nèi)精密度均<5%，日間精密度均<7%，符合方法學(xué)要求。

2.5.4加樣回收率試驗(yàn) 按上述方法制備血漿樣品，進(jìn)樣分析，計(jì)算待測物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得實(shí)測濃度，再乘以血漿體積得實(shí)測量，計(jì)算減去空白量的實(shí)測量與理論加入量的比值，得回收率。13種膽汁酸的回收率范圍為82.67%～109.75%。

2.5.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 同法制備血漿樣品，分別考察在室溫放置24 h、4℃放置24 h以及反復(fù)凍融下的穩(wěn)定性。結(jié)果RE%的范圍為-10.43%～13.16%，精密度均<15%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.6樣品的測定 健康受試者20名，肝癌患者50名。血漿樣品按本文“2.4”項(xiàng)下操作，并進(jìn)行測定，以待測物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(以EIC圖為準(zhǔn))，代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，求得血漿樣品中待測物的濃度。LC-MS圖譜見圖1，樣品測定結(jié)果見表3。

圖1 13種膽汁酸濃度圖譜

表3 健康受試者和肝癌患者血漿中13種膽汁酸測定結(jié)果

3 討論

3.1提取條件優(yōu)化 不同膽汁酸其羥基的數(shù)目和位置各異，理化性質(zhì)相差很大，加之血漿中各種膽汁酸的含量不盡相同，用一兩種提取溶劑很難將所有組分全部提取出來。液-液萃取和固相萃取法不僅操作煩瑣、耗時(shí)較長，而且提取效率難以保證。本研究采用蛋白沉淀法，只需少量血漿樣本，方法快速、簡便、高效。

3.2色譜條件優(yōu)化 由于各種膽汁酸的理化性質(zhì)差異較大，并且存在同分異構(gòu)體，短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)色譜分離比較困難，故本研究選用乙腈-甲酸-氨水緩沖

體系作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。分別考察了甲酸和氨水的濃度對靈敏度和分辨率的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)甲酸為0.1%，氨水為0.5%，流動(dòng)相呈弱堿性(pH=8)時(shí)，分離效果最佳。

3.3質(zhì)譜條件優(yōu)化 膽汁酸在負(fù)離子檢測模式下響應(yīng)較好，可以獲得穩(wěn)定的[M-H]-。質(zhì)譜參數(shù)通過流動(dòng)注射分析(FIA)方法進(jìn)行優(yōu)化，考察了干燥氣流速6～12 L/min、霧化器壓力30～50 psi，發(fā)現(xiàn)10 L/min和45 psi的組合霧化效果最好，靈敏度最佳。對于最重要的參數(shù)碎片電壓，考察了50～250 V，發(fā)現(xiàn)200 V的時(shí)候本底最低，響應(yīng)最好。

3.4健康受試者與肝癌患者膽汁酸濃度差異 由表3可知，健康對照組和原發(fā)性肝癌患者組的血清中膽汁酸的種類相似，未發(fā)現(xiàn)特異性的膽汁酸，LCA和TLCA的濃度極低，基本上檢測不到，分析原因可能是因?yàn)槟懼岬哪c-肝循環(huán)中，膽汁酸在腸道的重吸收主要依靠主動(dòng)重吸收方式，而LCA及其復(fù)合物可溶性差，因而大部分不被吸收而直接排出體外。另外，與健康對照組相比，原發(fā)性肝癌患者血漿以結(jié)合型膽汁酸升高為主，其中?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸TUDCA和TCDCA的含量超過健康人10倍以上，而TCA的含量升高也在5倍以上；兩種甘氨酸結(jié)合型膽汁酸包括GCA和GCDCA的含量也超過健康人達(dá)5倍以上，而其他6種膽汁酸除DCA外，含量也有一定升高，但與健康人相比差異不顯著。

4 小結(jié)

本研究所建方法實(shí)現(xiàn)了13種膽汁酸成分的同時(shí)檢測，靈敏度高、選擇性好、線性范圍寬，適用于臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)室研究；同時(shí)應(yīng)用該方法首次探討了原發(fā)性肝癌患者與健康人體內(nèi)血清膽汁酸的成分和含量差異，為肝癌患者體內(nèi)膽汁酸的代謝和疾病的臨床診治奠定基礎(chǔ)。

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