鄧晶晶，紀(jì)圣君，陳 燁，林曉琳，王 蕊，徐利鋒 (遼寧大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

藤甲酰苷(garcinia glycosides，GG)為藤黃酸類似物，應(yīng)用二苯基溴化四氮唑藍(lán)(MTT)比色法測定GG對8種人癌細(xì)胞的體外作用，GG能明顯抑制HL-60及B16人癌細(xì)胞的體外生長。根據(jù)細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則[1]要求，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)初步了解受試物的作用機(jī)制、敏感腫瘤類型和作用強(qiáng)度后，需進(jìn)行動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。但由于傳統(tǒng)的動物體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)動物和待測樣品的量、時(shí)間及人力的投入都較大，并且某些腫瘤細(xì)胞株在動物體內(nèi)無成瘤性，限制了抗腫瘤藥物的篩選和研究進(jìn)展。因此，本實(shí)驗(yàn)采用Hollingshead等[2]于1995年首先提出的中空纖維測定法，并在此法的基礎(chǔ)上改進(jìn)，測定GG對8種人癌細(xì)胞的體內(nèi)生長抑制作用，同時(shí)選取HL-60及B16人癌細(xì)胞進(jìn)行裸鼠體內(nèi)腋下移植瘤實(shí)驗(yàn)，以評價(jià)中空纖維測定法模型用于藥效學(xué)篩選的可靠性，為GG的后續(xù)研究提供更有力的實(shí)驗(yàn)支持。

中空纖維測定法已被美國國立癌癥研究所(NCI)使用多年，用于高通量篩選抗腫瘤藥物，并且已被美國FDA認(rèn)可，但我國尚未廣泛應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)將對該方法的推廣與使用起到積極作用。

1 材料與儀器

1.1材料

1.1.1藥物與試劑 GG(含量>98.5%，遼寧大學(xué)藥學(xué)院自制)；CTX(山西普德藥業(yè)有限公司)；聚丙乙烯中空纖維(內(nèi)徑600 μm，厚度200 μm，孔徑0.64 μm，德國Membrana公司)； MTT(沈陽寶信生物科技有限公司)；IMDM培養(yǎng)基(Gibco)、F-12培養(yǎng)基(Gibco)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)、FBS(Gibco)和二甲基亞砜(DMSO)均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2細(xì)胞株 白血病細(xì)胞HL-60(ATCC)、結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo(ATCC)、黑色素瘤細(xì)胞B16(ATCC)，均購自上海拜力生物科技有限公司；人肝癌細(xì)胞SMMC-7721(ATCC)、人乳腺癌細(xì)胞T-47D(ATCC)、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8(ATCC)、人肺癌細(xì)胞A549(ATCC)，均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞GIST882(ATCC)購自上海眾華生物科技有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動物 免疫缺陷小鼠NOD/SCID，雌性，4～5周齡，體重18～22 g。BALb/c胸腺免疫缺陷小鼠(裸鼠)，雄性，4～5周齡，體重18～22 g，均飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2儀器 超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo SCIENTIFIC)；熒光倒置顯微鏡(Olympus CKX41)；Sunrise酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1用中空纖維測定法測定GG對8種人癌細(xì)胞的生長抑制作用

2.1.1細(xì)胞培養(yǎng) 將白血病細(xì)胞HL-60于IMDM完全培養(yǎng)基(含20%FBS)中培養(yǎng)；結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo培養(yǎng)于F-12K完全培養(yǎng)基(含10%FBS)；黑色素瘤細(xì)胞B16培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基(含10%FBS)；人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、人肺癌細(xì)胞A549及人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞GIST882均培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%FBS)；人乳腺癌細(xì)胞T-47D培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基(含20%FBS)。各種腫瘤細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育備用。

2.1.2實(shí)驗(yàn)方法[3-5]分別取對數(shù)生長期的上述8種人癌細(xì)胞，貼壁細(xì)胞胰酶消化成單細(xì)胞，用各自培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/ml，無菌注射器注入2 cm長的無菌中空纖維管中，止血鉗將中空纖維管兩端熱封。將待移植的中空纖維管放入盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。取4～5周齡NOD/SCID小鼠，按每20 g體重尾部靜脈注射10%水合氯醛60 μl，背部脫毛，碘酒擦拭脫毛部位，75%乙醇脫碘，于無菌操作臺中將孵育了24 h的中空纖維管埋入小鼠背部一側(cè)皮下，每只小鼠植入4支中空纖維管(圖1)，接種后將小鼠傷口縫合，在傷口部位涂拭青霉素溶液，以防細(xì)菌感染。

圖1 中空纖維管包埋圖

實(shí)驗(yàn)設(shè)溶劑對照組(1‰ DMSO水溶液)、GG高劑量組8 mg/(kg·d)、中劑量組4 mg/(kg·d)及低劑量組2 mg/(kg·d)，每組各6只鼠，接種3 d后隨機(jī)分組，開始于小鼠尾部靜脈注射給藥，連續(xù)給藥4 d。

給藥結(jié)束24 h后處死小鼠，取出中空纖維管。用PBS緩沖液將中空纖維管外壁洗凈，放入24孔培養(yǎng)板中，每孔放入一支，加入300 μl培養(yǎng)基，每孔加入20 μl MTT溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h(圖2)。孵育結(jié)束后將中空纖維管從中間剪斷，擠壓去除內(nèi)壁及外壁的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入另一24孔培養(yǎng)板中，室溫晾干，加入250 μl DMSO， 室溫脫色搖床振搖1 h，使MTT孵育生成的藍(lán)色結(jié)晶甲臜充分溶于DMSO中(圖3)，移取150 μl該溶液于96孔培養(yǎng)板中，酶標(biāo)儀490 nm檢測各組OD值(圖4)，計(jì)算腫瘤生長抑制率。

抑制率=(1-給藥組OD值/溶劑對照組OD值)×100%。

圖2 中空纖維管MTT孵育

圖3 DMSO溶解中空纖維管中甲臜

圖4 96孔板中酶標(biāo)儀檢測

2.2應(yīng)用裸鼠體內(nèi)異位移植模型測定GG對HL-60及B16人癌細(xì)胞的生長抑制作用

2.2.1實(shí)驗(yàn)方法[6，7]按“2.1.1”項(xiàng)下培養(yǎng)方法收集足夠的細(xì)胞，重懸于無血清培養(yǎng)基中，分別接種于4～5周齡的BALb/c裸鼠右下肢外側(cè)皮下(HL-60細(xì)胞濃度為8×106/只，B16細(xì)胞濃度為3×106/只)，分別接種55～60只。2種細(xì)胞各設(shè)5組：GG高劑量組8 mg/(kg·d)、中劑量組4 mg/(kg·d)、低劑量組2 mg/(kg·d)、陽性對照組[CTX 15 mg/(kg·d)]及溶劑對照組(1‰ DMSO水溶液)，每組8～10只鼠。待腫瘤長至黃豆大小時(shí)開始腹腔給藥，連續(xù)給藥10 d。給藥結(jié)束24 h后處死小鼠，取出瘤塊，測量腫瘤重量G，計(jì)算腫瘤生長抑制率。

抑制率=(1- G給藥組/G溶劑組)×100%。

2.3結(jié)果

2.3.1中空纖維測定法測定GG對8種人癌細(xì)胞的生長抑制作用結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GG高劑量、中劑量能明顯抑制HL-60及 B16人癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長，各組OD值與溶劑對照組比較，均有顯著性差異(P<0.01)。GG高、中劑量組對HL-60癌細(xì)胞的抑瘤率>50%，P<0.01；GG高、中劑量組對B16癌細(xì)胞的抑瘤率>50%，高劑量組P<0.01、中劑量組P<0.05。GG對其他6種人癌細(xì)胞的抑瘤率均在50%以下，表明GG對它們的生長無抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 中空纖維測定法測定GG對8種人癌細(xì)胞的生長抑制作用結(jié)果

1)P<0.05，與溶劑對照組比較；2)P<0.01，與溶劑對照組比較

2.3.2裸鼠體內(nèi)異位移植模型測定GG對HL-60及B16人癌細(xì)胞的生長抑制作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GG高劑量、中劑量能明顯抑制HL-60及 B16人癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長，各組瘤重與溶劑對照組比較，均有顯著性差異(P<0.01)，低劑量組及CTX組的瘤重也小于溶劑組，但無顯著性差異(P>0.05 )。GG高、中劑量組對HL-60癌細(xì)胞的抑瘤率>50%，P<0.01；CTX組P>0.05。GG高、中劑量組對B16癌細(xì)胞的抑瘤率>50%，P<0.01；CTX組P>0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 裸鼠體內(nèi)異位移植模型測定GG對人癌細(xì)胞的生長抑制作用結(jié)果

1)P<0.05，與溶劑對照組比較；2)P<0.01，與溶劑對照組比較

3 討論

中空纖維測定法由Hollingshead等[2]于1995年首先發(fā)明并應(yīng)用，是目前唯一體內(nèi)高通量篩選抗腫瘤藥物的模型，已被NCI使用多年，并已得到美國FDA的認(rèn)可，我國目前尚未推廣應(yīng)用。中空纖維管為氟化聚乙烯制成的半透膜中空管，其分子截留值為500 000，它耐有機(jī)溶劑、酸、堿和高溫，具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性[8]。與傳統(tǒng)的動物移植瘤模型相比，該法使用動物量及受試藥量少、實(shí)驗(yàn)周期短(7～8 d)、 一次可篩選多種細(xì)胞(3～4個(gè))、各細(xì)胞株之間無干擾、可提供全真的體內(nèi)環(huán)境、均一性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，大大提高了傳統(tǒng)移植瘤實(shí)驗(yàn)的效率，節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用。

中空纖維測定法測得GG高、中劑量組對HL-60及B16人癌細(xì)胞的生長抑制率>50%，表明GG對2種人癌細(xì)胞有較好生長抑制作用；GG對其他6種人癌細(xì)胞生長抑制率均<50%，表明GG對其他6種人癌細(xì)胞無生長抑制作用。因此，選擇HL-60及B16人癌細(xì)胞進(jìn)行裸鼠體內(nèi)異位移植瘤實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證GG對這兩種人癌細(xì)胞的生長抑制作用。

本試驗(yàn)采用中空纖維測定法這一新型的藥物篩選模型，評價(jià)GG對人癌細(xì)胞的生長抑制作用，并采用裸鼠體內(nèi)異位移植瘤實(shí)驗(yàn)對其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，中空纖維測定法檢測到的GG高、中劑量對HL-60及B16人癌細(xì)胞的抑瘤率與采用裸鼠體內(nèi)異位移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測的結(jié)果基本一致，驗(yàn)證了中空纖維測定法用于體內(nèi)高通量篩選抗腫瘤藥物的可靠性。與傳統(tǒng)體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)比較，該法具有簡便、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)、省力、快速、均一性良好及高通量等優(yōu)點(diǎn)，作為從體外實(shí)驗(yàn)到傳統(tǒng)體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)的過渡環(huán)節(jié)，中空纖維測定法為GG這一創(chuàng)新藥物的抗腫瘤篩選提供了更好的選擇和實(shí)驗(yàn)證明，使大規(guī)模動物體內(nèi)藥效學(xué)評價(jià)成為可能。GG高、中劑量對HL-60及B16人癌細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，且藥效明顯優(yōu)于CTX，顯示出GG的抗腫瘤優(yōu)越性，為繼續(xù)研究GG、尋找抗腫瘤替代藥物指明了方向。

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