趙文軍，林 陽，李鵬飛，劉 洋(.沈陽軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽 006；.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 00433)

牡丹皮(Moutan cortex)為臨床常用中藥，系毛茛科芍藥屬植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr)的干燥根皮，在我國主產(chǎn)于安徽、山東、四川、陜西等地[1]。牡丹皮資源豐富，具有顯著抗炎[2]、抗糖尿病[3]、保護(hù)缺血組織[4]、抗腫瘤[5]的等藥理活性，因而具有良好的開發(fā)前景。

中外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)牡丹皮的主要化學(xué)成分為沒食子酸、芍藥苷衍生物、沒食子酰糖苷等[6-8]。對牡丹皮中化學(xué)成分分析已有文獻(xiàn)報(bào)道[9，10]，以采用傳統(tǒng)的植物化學(xué)的方法進(jìn)行分離提取居多。液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-QTOFMS)對于中藥復(fù)雜體系中化學(xué)成分分析和鑒定非常有效。其靈敏度高，可以在短時(shí)間獲得化合物的準(zhǔn)確分子質(zhì)量，通過比對已建立的已知化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，能對被測成分進(jìn)行快速分析鑒別。因此，相比于傳統(tǒng)的中藥分析手段，在線聯(lián)用技術(shù)具有顯著的優(yōu)越性[11]。本研究采用HPLC-QTOFMS技術(shù)對牡丹皮中多成分進(jìn)行了鑒別，該法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，對闡明牡丹皮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制、開發(fā)現(xiàn)代中藥新藥等具有重要意義。

1 儀器與試藥

安捷倫-1200液相色譜系統(tǒng)，包括在線脫氣機(jī)、二元泵、高性能自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱；安捷倫-6530高分辨四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(ESI)，Masshunter工作站和Analyst Qualitative Analysis質(zhì)譜分析軟件；KUDOS SK2200H型超聲器(上海科導(dǎo)超聲儀器公司)；METTLER AE240型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；DJ-04型藥材粉碎機(jī)(上海淀久公司)，高速離心機(jī)(美國Abbort公司)。

HPLC級乙腈(德國Merck公司)；HPLC級甲酸(美國Tedia公司)；無水乙醇為分析純(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)，水為娃哈哈純凈水。丹皮酚、芍藥苷和沒食子酸對照品(純度﹥98%，中國藥品生物制品檢定所)。牡丹皮藥材(上海德康大藥房，產(chǎn)地安徽，批號：100622)。

2 方法

2.1色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1色譜條件色譜柱 SHISEIDO CAPCELL PAK C18(3.0×100 mm, 3 μm)；流動(dòng)相：0.1 %甲酸水溶液(A相)-乙腈(B相)，梯度洗脫：0～3 min, 5% B; 3～15 min, 5%～20% B; 15～25 min, 20%～27% B; 25～34 min, 27%～46% B; 34～40 min, 46%～95% B；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：2 μl；流速：0.5 ml/min；進(jìn)樣前以流動(dòng)相梯度初始條件平衡10 min。

2.1.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，分別在正、負(fù)離子模式下檢測：采用三通分流閥，柱后分流比為1:1，使大約1/2體積的液相洗脫液進(jìn)入質(zhì)譜檢測。具體參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓正離子模式4 000 V，負(fù)離子模式3 500 V，霧化氣壓力35 psi，干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度350℃，碎片電壓150 V；質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z100～1 200。每次測定樣品之前，采用混標(biāo)調(diào)諧液(turning mixture)校準(zhǔn)質(zhì)量軸，以保證質(zhì)量精度誤差﹤5 ppm。

2.2供試品溶液的制備 取牡丹皮藥材適量，粉碎后過40目篩，稱取牡丹皮藥材0.5 g，置100 ml錐形瓶中，加80%乙醇50 ml，超聲處理30 min(超聲功率為400 W，頻率60 kHz)，冷卻后補(bǔ)足失重。取5 ml醇提液，10 800 r/min離心5 min，取上清，再用微孔濾膜過濾(0.45 μm)過濾，作為供試品溶液。在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析。

2.3對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、芍藥苷、丹皮酚對照品加甲醇溶解于適當(dāng)量瓶中，配成濃度分別為36.01、42.23、43.12 μg/ml的混合對照品溶液，作為對照品儲備液，分別取各對照品混合液稀釋混合后，進(jìn)樣分析。

2.4牡丹皮化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立 檢索美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的PubMed數(shù)據(jù)庫、美國化學(xué)學(xué)會SciFinder數(shù)據(jù)庫和清華大學(xué)的CNKI數(shù)據(jù)庫，將文獻(xiàn)中有關(guān)牡丹皮的化合物數(shù)據(jù)進(jìn)行全面收集整理，利用安捷倫“formula_database_generator”軟件建立了75個(gè)牡丹皮化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫，包括沒食子酸、芍藥苷衍生物、沒食子酰糖苷類等化學(xué)成分，并對其化合物名稱、結(jié)構(gòu)、化學(xué)式、精確分子量信息進(jìn)行系統(tǒng)整理。

3 結(jié)果與討論

3.1色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)初始筆者分別考察了不同品牌、規(guī)格的色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAPCELL PAK C18柱(3.0 mm×100 mm, 3 μm)分析時(shí)間更短并且峰形更好，適合牡丹皮不同化學(xué)成分的分離。乙腈-水體系的分離時(shí)間較甲醇-水短，可以提高分離效率，而乙腈-0.1%甲酸水的體系能使化合物得到更好的分離效果。

實(shí)驗(yàn)中分別采用了正、負(fù)離子模式進(jìn)行全掃描檢測。在負(fù)離子模式下，基質(zhì)干擾較少，且牡丹皮成分響應(yīng)很高。而在正離子模式下，少部分成分響應(yīng)較差，但能得到牡丹皮主要成分的碎片離子以有助于成分的鑒別。因此，最終采用以負(fù)離子模式為主，正離子為輔的檢測策略。QTOFMS參數(shù)優(yōu)化項(xiàng)主要包括：毛細(xì)管電壓、干燥氣流速和溫度、霧化氣壓力及碎裂電壓等。其中碎裂電壓直接影響被分析物的母離子在源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離，實(shí)驗(yàn)選擇了120～420 V范圍內(nèi)的不同碎裂電壓值，通過調(diào)節(jié)碎片電壓獲得豐富的碎片離子信息，幫助進(jìn)行化合物鑒別和結(jié)構(gòu)確證。

3.2牡丹皮中主要化學(xué)成分的鑒別與結(jié)果解析 在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下，牡丹皮提取液的HPLC-QTOFMS典型總離子流圖見圖1。筆者對主要的48個(gè)色譜峰(表1)進(jìn)行鑒別，其中有17種單萜類成分、11種沒食子酰類成分(鞣質(zhì))、8種酚酸類成分、7種苯乙酮類成分、4種黃酮類成分、1種三萜類成分?；衔镨b別方法如下：首先，根據(jù)TOFMS上所得到的精確分子量信息，典型的分子離子主要有[M+H]+、[M+Na]+、[M-H]-和[M+HCOO]-等，此外沒食子酰類成分在負(fù)離子模式下還容易形成特征性的[M-2H]2-離子，通過MassHunter軟件在5 ppm的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)計(jì)算其可能的元素組成，并將其與所建的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行自動(dòng)匹配，對牡丹皮化學(xué)成分進(jìn)行初步鑒別。隨后采用動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)碎裂電壓的方式對其中5對同分異構(gòu)體進(jìn)行鑒別，選擇合適的分子離子峰或基峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)，通過二級質(zhì)譜的裂解方式，獲得化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子，根據(jù)離子的裂解情況并結(jié)合數(shù)據(jù)庫中各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，區(qū)分各同分異構(gòu)體。

3.2.1同分異構(gòu)體的鑒別區(qū)分 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)牡丹皮提取液中含有大量的同分異構(gòu)體，其中大部分是單萜類和沒食子酰類成分，這與自建的牡丹皮已知化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫相符。以峰9和峰15為例，二者精確分子質(zhì)量同為480.163 2，負(fù)離子模式下，其m/z為525.160 8([M+HCOO]-)，其元素組成為C23H28O11，可能是芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷。僅僅利用TOF所得的各化合物的準(zhǔn)分子離子的精確質(zhì)荷比無法對其區(qū)分，根據(jù)兩個(gè)化合物的對照品相對保留時(shí)間可鑒定峰9為芍藥內(nèi)酯苷，峰17為芍藥苷。芍藥內(nèi)酯苷可以直接脫去一個(gè)苯甲酸，生成m/z357.1191[M-H-benzoic acid]-，再脫掉一個(gè)葡萄糖單體生成m/z195.066 0[M-H-benzoic acid-glucose]-。芍藥苷能特征性地脫去相對分子質(zhì)量為31的H-CH2O,得到m/z449.1934[M-H-CH2O]-,并繼續(xù)脫掉一個(gè)苯甲酸生成m/z327.1076[M-H-CH2O-benzoic acid]-,再脫掉一個(gè)葡萄糖單體生成m/z165.0558[M-H-CH2O-benzoic acid-glucose]-。除此以外,兩個(gè)化合物苷配基上均連接有苯甲酸，在碎片電壓足夠高的時(shí)候，能產(chǎn)生m/z121[benzoic acid-H]-。峰10和峰12，峰36和峰37，峰38和峰48采用相同策略進(jìn)行同分異構(gòu)體差別區(qū)分。

圖1 牡丹皮樣品正離子模式(A)與負(fù)離子模式(B)的HPLC-QTOF總離子流圖

表1 牡丹皮提取物中主要化學(xué)成分的定性分析結(jié)果

續(xù)表1

峰13和峰17所代表的化合物的精確分子質(zhì)量同為636.096 3，在負(fù)離子模式下，其質(zhì)荷比分別為m/z635.088 5 [M-H]-，其元素組成為C27H23O18，與數(shù)據(jù)庫中相對應(yīng)的分子式為C27H24O18，可能是三沒食子酰葡萄糖及其同分異構(gòu)體。峰21,23和24所代表化合物的精確分子質(zhì)量同為788.107 2，負(fù)離子模式下，其質(zhì)荷比分別為m/z787.099 4 [M-H]-，其元素組成為C34H27O22，與數(shù)據(jù)庫中相對應(yīng)的分子式為C34H28O22，可能是四沒食子酰葡萄糖及其同分異構(gòu)體。峰30,31和32所代表化合物的精確分子質(zhì)量同為1 092.129 1，負(fù)離子模式下，其質(zhì)荷比分別為m/z1 091.121 3[M-H]-，其元素組成為C48H35O30，正離子模式下，其質(zhì)荷比分別為m/z1115.118 9 [M+Na]+，其元素組成為C48H36O30Na，與數(shù)據(jù)庫中相對應(yīng)的分子式為C48H36O30，可能是六沒食子酰葡萄糖及其同分異構(gòu)體。以六沒食子酰葡萄糖為例，說明其裂解情況。當(dāng)碎片電壓較低時(shí)，能產(chǎn)生m/z1091.123 9[M-H]-，同時(shí)產(chǎn)生m/z545.054 8 [M-2H]2-。當(dāng)碎片電壓較高時(shí)，產(chǎn)生一系列脫掉沒食子酸或沒食子?；鶊F(tuán)的離子，包括：m/z939.110 3 [M-H-152]-，m/z769.089 5 [M-H-152-170]-，617.075 6 [M-H-152-170-152]-，599.065 6 [M-H-152-170-152]-，447.0687 [M-H-152-170-152-152]-等。從以上觀察得到，化合物30,31和32為六沒食子酰葡萄糖及其同分異構(gòu)體。較低和較高電壓的質(zhì)譜圖如圖2所示。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-QTOFMS技術(shù)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫匹配和二級質(zhì)譜分析，實(shí)現(xiàn)了對牡丹皮中主要成分的快速定性分析，共鑒定出48個(gè)主要成分，對5組同分異構(gòu)體化合物進(jìn)行了明確化區(qū)分。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確度高，可作為牡丹皮質(zhì)量控制的方法之一，同時(shí)為牡丹皮的藥理學(xué)和臨床藥學(xué)研究提供了化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)信息。

圖2 較低(A)和較高(B)電壓的質(zhì)譜圖

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