李 娜，婁子洋 (第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

藥品作為特殊商品，保證其安全、有效、質(zhì)量可控是藥品研發(fā)和評(píng)價(jià)應(yīng)遵循的基本原則。雜質(zhì)的研究貫穿于整個(gè)藥品研究的始終。藥品中的雜質(zhì)是否能被全面準(zhǔn)確地加以控制，直接關(guān)系到藥品的質(zhì)量可控性與安全性，雜質(zhì)研究及控制是藥品質(zhì)量保證的關(guān)鍵要素之一。SFDA將藥物雜質(zhì)定義為任何影響藥物純度的物質(zhì)[1]。雜質(zhì)按其理化性質(zhì)一般分為：有機(jī)雜質(zhì)、無機(jī)雜質(zhì)及殘留溶劑。

FDA對(duì)雜質(zhì)的控制十分嚴(yán)格，不僅在上市前嚴(yán)格把關(guān)，上市后仍然密切跟蹤。表1列出了幾種因?yàn)殡s質(zhì)原因被FDA召回的藥物[2]，其中包括第三類藥物，即不會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生副作用的藥物。

表1 FDA召回的一些藥物(2011.9-2012.3)

1 藥物雜質(zhì)的指導(dǎo)原則

最初人們出于對(duì)藥物安全性的考慮從而開始關(guān)注雜質(zhì)的研究，有關(guān)案例表明某些雜質(zhì)會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生副作用。例如，四環(huán)素的降解產(chǎn)物會(huì)引起Fanconi′ s綜合征，最終導(dǎo)致腎衰竭；在肝素中出現(xiàn)含硫磺過多的硫磺軟骨素引起過敏反應(yīng)，導(dǎo)致100多人死亡[3]。另外，一些雜質(zhì)和降解產(chǎn)物還會(huì)產(chǎn)生遺傳毒性，這些成分可以引起基因突變、染色體斷裂、染色體重排或其他毒性作用[4]，甚至導(dǎo)致癌變。目前，很多監(jiān)管機(jī)構(gòu)都對(duì)雜質(zhì)給予了密切的關(guān)注(表2)。

表2 國際上常見的指導(dǎo)原則

在原料藥研究中，大多數(shù)研究者都遵循人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)頒布的《新原料藥的雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則》中的要求，該指導(dǎo)原則規(guī)定：在原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中任意一個(gè)單個(gè)非特定雜質(zhì)的限度不得超過鑒定限度(表3)[2]。而對(duì)于制劑而言，由于原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已對(duì)各雜質(zhì)進(jìn)行了控制，在制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅控制降解產(chǎn)物，故在《新制劑的雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則》中規(guī)定：在制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中任意一個(gè)單個(gè)非特定降解產(chǎn)物的限度不得過鑒定限度(表4)[5]。

表3 原料藥的雜質(zhì)限度

表4 制劑的雜質(zhì)限度

從以上的指導(dǎo)原則也可以看出，國際上對(duì)非特定雜質(zhì)的限度有著嚴(yán)格的要求。《中國藥典》對(duì)雜質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)也做了明確的規(guī)定，“在藥物臨床使用前必須確證藥物中含量在0.1%及其以上的雜質(zhì)和表觀含量在0.1%以下但具強(qiáng)生物作用的雜質(zhì)或毒性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，在穩(wěn)定性試驗(yàn)中生成的降解產(chǎn)物，也要求進(jìn)行定性和定量研究”[6]。SFDA于2005年頒布了首部雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》，這對(duì)中國藥物研發(fā)中的雜質(zhì)研究起到了一定的控制作用。

2 雜質(zhì)的定性研究

2.1 傳統(tǒng)雜質(zhì)鑒定技術(shù) 因?yàn)殡s質(zhì)的含量少，故檢測(cè)方法至關(guān)重要，必須選擇專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的方法。常用雜質(zhì)分離檢測(cè)技術(shù)包括高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、毛細(xì)管色譜(CE)、毛細(xì)管電色譜(CEC), 親水作用液相色譜(HILIC)、超高效液相色譜(UHPLC)等，常用檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器(UV)、 熒光檢測(cè)器(FLD)、 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)、電噴霧檢測(cè)器(CAD)等[7，8]。另外,還可以利用不同技術(shù)聯(lián)合進(jìn)行分離，如HPLC與CE聯(lián)用[9]，HILIC與LC聯(lián)用[10],反相液相色譜(RPLC)與超臨界流體色譜(SFC)聯(lián)用[11]等，這些方法充分利用了各自不同的選擇性，確保對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行有效的分離。紅外、紫外、核磁、質(zhì)譜等4大光譜是檢測(cè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的有力保證。

過去很長一段時(shí)間內(nèi)，人們一直沿用上述手段進(jìn)行研究，但是仍然具有其局限性。例如，當(dāng)一個(gè)樣品中含有多個(gè)雜質(zhì)時(shí)就要考慮怎樣完全分離的問題，但是當(dāng)雜質(zhì)的含量很少，并且濃縮過程不理想的時(shí)候，整個(gè)過程就變得困難了。遇到這種問題，通常的解決方法是依靠制備色譜柱多次循環(huán)進(jìn)行制備，但是這個(gè)過程中同時(shí)存在著雜質(zhì)不穩(wěn)定，或存在進(jìn)行二次反應(yīng)的問題等。隨著質(zhì)譜等儀器的應(yīng)用，人們開始將串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)作為對(duì)痕量雜質(zhì)進(jìn)行鑒別和鑒定的首要選擇，例如GC-MS，LC-MS，CE-MS，LC-NMR/MS等，尤其是LC-MS的應(yīng)用最為廣泛。

2.2 常用的現(xiàn)代聯(lián)用技術(shù)

2.2.1 GC-MS GC-MS是最先被使用的聯(lián)用技術(shù)，對(duì)有機(jī)揮發(fā)性雜質(zhì)和殘留溶劑的測(cè)定是不可或缺的工具，但大多數(shù)有機(jī)雜質(zhì)的某些性質(zhì)預(yù)先無法得知，例如揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性。所以用GC-MS來測(cè)定藥品中的雜質(zhì)的報(bào)道較少。

在這些為數(shù)不多的報(bào)道中， GC-MS曾被用來鑒定非法銷售的含有苯丙胺衍生物的搖頭丸中的雜質(zhì)[12,13]。任麗萍等[14]利用GC-MS技術(shù)對(duì)丁草胺原藥中的主要雜質(zhì)進(jìn)行定性分析，共鑒定出l1種主要組分，其中10種為雜質(zhì)。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷出11種組分的結(jié)構(gòu)式，并利用丁草胺標(biāo)樣的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)丁草胺有效成分進(jìn)行了確認(rèn)。Chen等[15]用GC-MS和超聲分子束技術(shù)結(jié)合來鑒定伯氨喹及其片劑中的喹西特。這種技術(shù)可以提供明顯的分子離子峰，還可以提供藥物和同位素污染物的不同裂解行為。

GC-MS也同其他技術(shù)結(jié)合來鑒定藥物雜質(zhì)。Laniewsk等用GC-MS、GC-AED(原子發(fā)射檢測(cè)器)和GC-FT-IR來鑒定叔丁基-2-F-3-羥丙基-氨基甲酸鹽中的未知雜質(zhì)，其中GC-MS提供未知物的分子量和碎片離子信息[16]。該作者又采用GC-MS、GC-AED和NMR鑒定1,3-二氯-5- (difluoromethoxy)苯中的4個(gè)副產(chǎn)物。其中1個(gè)是利用GC-MS數(shù)據(jù)庫鑒定出來的，2個(gè)是結(jié)合GC-MS和GC-AED鑒定出來的，第4個(gè)是GC-MS、GC-AED和NMR互相補(bǔ)充鑒定出來的[17]。

GC-MS由于儀器的局限性，其應(yīng)用逐漸減少。目前LC-MS和CE-MS這兩類檢測(cè)技術(shù)都有較大的發(fā)展，在雜質(zhì)鑒定方面應(yīng)用十分廣泛。

2.2.2 LC-MS LC-MS一系列的儀器在雜質(zhì)鑒定方面是最常用的，雖然問世時(shí)間不如GC-MS早，但發(fā)展卻十分迅速。LC-MS總體來說主要分為三類，分別為高分辨率質(zhì)譜(HRMS)，多級(jí)質(zhì)譜(MSn)，氫/氘轉(zhuǎn)換質(zhì)譜(HDE-MS)。

對(duì)于HRMS，以飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF)為例，可以提供精確到小數(shù)點(diǎn)后4～6位的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)，使得儀器分辨率和相對(duì)分子質(zhì)量的精確度得到飛速發(fā)展，反過來幫助得到準(zhǔn)確的元素組成。例如，CH2和N的Mr都是14 000，利用此類儀器可以根據(jù)其精確相對(duì)分子質(zhì)量輕松地區(qū)別出來，Mr分別是14.015 7和14.003 1。由于高分辨質(zhì)譜的精確性，使得其在化合物結(jié)構(gòu)鑒定方面有著較多的應(yīng)用[18-21]。

MSn可以提供豐富的碎片離子信息以及裂解信息，利用得到的數(shù)據(jù)可以推測(cè)出藥物及其雜質(zhì)的裂解模式，進(jìn)而結(jié)合已有的知識(shí)鑒定出未知化合物的結(jié)構(gòu)。Wang等[22]用RPLC-Q-IT/MS分析藥物乙酰螺旋霉素(ASPM)，共鑒定出83種化合物，其中31種雜質(zhì)是之前文獻(xiàn)未報(bào)道過的，該藥物大多數(shù)雜質(zhì)是原料或合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)。 MSn還可以區(qū)分具有相同精確相對(duì)分子質(zhì)量的離子。Mehta等[23]利用該類儀器得到了坎地沙坦西酯中m/z441.167 0，423.156 4, 395.150 3和 380.139 4的兩種不同結(jié)構(gòu)的裂解途徑。該類儀器中，離子阱比LC-MS/MS更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)長C-MS/MS只能提供二級(jí)數(shù)據(jù)。

第三類儀器，也就是HDE-MS，是一種研究蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的質(zhì)譜技術(shù)，可以提供結(jié)構(gòu)中活潑氫的數(shù)量，這樣就獲得了一些官能團(tuán)的信息，如-OH、-NH2或-NH、-SH、-COOH。近年來，在雜質(zhì)鑒別方面逐漸得到應(yīng)用。此外，HDE還可以在具有相同元素組成、相同裂解模式化合物的多種結(jié)構(gòu)中選擇最可能的結(jié)構(gòu)。David等[24]闡述了LC-MS HDE對(duì)藥物制備過程中的雜質(zhì)進(jìn)行鑒別的步驟。Shah等[25]聯(lián)合LC-MS/TOF、 MSn、在線HDE和LC-NMR對(duì)厄貝沙坦中的降解產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，通過MS/TOF、MSn和HDE給出裂解途徑，對(duì)目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)，利用1HNMR，2D-COSY 和LC-NMR對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，最終鑒定出3個(gè)降解產(chǎn)物。

除了以上方法之外，放射性核素(同位素)和氮規(guī)則也可以輔助進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。例如，含有鹵素的化合物具有唯一的同位素峰，尤其是氯和溴。37Cl和35Cl在自然界的相對(duì)豐度分別是24.24%和75.77%，而溴的同位素79Br和81Br的相對(duì)豐度分別為50.69%和49.31%。同樣的，硫元素也可以通過同位素峰來證明其存在，32S、33S、34S的相對(duì)豐度分別是95.03%、0.75%、4.22%。將精確相對(duì)分子質(zhì)量和同位素峰結(jié)合起來在高分辨儀器(TOF,FT-ICR)中可以得到未知化合物的元素組成[26]。

2.2.3 CE-MS 近些年CE和CEC分離雜質(zhì)也是比較常用的技術(shù)。CEC是一種混合技術(shù)，包含了CE的高效性，以及LC中流動(dòng)相和固定相的選擇性。目前，在鑒別雜質(zhì)方面CE和CEC與質(zhì)譜串聯(lián)也獲得了巨大的進(jìn)步。

CE的離子化技術(shù)主要包括電噴霧離子化(ESI)，大氣壓化學(xué)離子化(APCI)，大氣壓光離子化(APPI)和熱噴霧離子化(TSI)。ESI和TSI適用于分析溶液中帶電荷的化合物。APCI和APPI的靈敏度較低，但是低、高極性的化合物都可以被其電離。分析帶電化合物時(shí)，4種離子源的靈敏度順序分別為ESI≥TSI >APCI≈APPI。4種離子源得到的碎片離子的信息也有不同之處：ESI、TSI和APCI只能產(chǎn)生帶偶數(shù)電荷的離子，而APPI既可以產(chǎn)生偶數(shù)電荷的離子，又可產(chǎn)生奇數(shù)電荷的離子。通常連接CE的質(zhì)量檢測(cè)器包括四極桿檢測(cè)器(Q)，三重四極桿檢測(cè)器(TQ)，離子阱檢測(cè)器(IT)，飛行時(shí)間檢測(cè)器(TOF), 傅立葉變換回旋共振檢測(cè)器(FT-ICR)。

Bertinatto等用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)檢測(cè)并鑒定了伊班膦酸鹽中的相關(guān)雜質(zhì)，并從專屬性、精密度、線性和準(zhǔn)確度層面對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，該方法檢測(cè)限為2 μg/ml, 定量限為7 μg/ml[27]。Wijk等[28]用非揮發(fā)性的緩沖液對(duì)一些基本藥物進(jìn)行了分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大多數(shù)藥物的檢測(cè)限都能達(dá)到0.05%，證明CE對(duì)它們的檢測(cè)是適用的。而膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法(MEKC)的分離主要取決于被分離的化合物在假固定相和緩沖液中分配系數(shù)的差異，而這種差異主要是利用高電壓的時(shí)候化合物遷移速度不同而產(chǎn)生的。有報(bào)道采用MEKC-MS對(duì)加蘭他敏和異丙托銨進(jìn)行了雜質(zhì)譜的分析。在該研究中，通過MEKC-MS/MS對(duì)異丙托銨中2個(gè)高溫降解產(chǎn)物進(jìn)行了鑒別和鑒定[29]。

利用CE來鑒別雜質(zhì)的藥物還有很多，比如左旋肉堿[30]，利托納韋等[31]。

以上列出常用的聯(lián)用技術(shù)，還有一些在雜質(zhì)分析中可以使用到的技術(shù)，例如SFC-MS[32]、LC-NMR[33]、CE-NMR[34]、LC-FTIR[35]等。

3 雜質(zhì)的定量研究

按照ICH的規(guī)定將高于定量限度的雜質(zhì)成分全部給予定量或限量?！痘瘜W(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]中藥物有機(jī)雜質(zhì)的定量方法一般多采用色譜法，包括峰面積歸一化法、不加校正因子的主成分自身對(duì)照法、加校正因子的主成分自身對(duì)照法、外標(biāo)法(雜質(zhì)對(duì)照品法)。

在質(zhì)譜應(yīng)用領(lǐng)域里三重四極桿是靈敏度和定量重現(xiàn)性最好的儀器。檢測(cè)限較低，可應(yīng)用于復(fù)雜的體系中對(duì)成分進(jìn)行定量而不需進(jìn)行衍生化，既提高了實(shí)驗(yàn)效率，又提供了更加可靠的測(cè)試結(jié)果。Székely等[36]利用三重四極桿質(zhì)譜，采用多反應(yīng)檢測(cè)掃描模式(MRM)對(duì)糖皮質(zhì)激素中的具有潛在遺傳毒性的微量雜質(zhì)4-二甲基氨基吡啶進(jìn)行定量測(cè)定。最低定量限為0.5 ng/ml，即在5 mg/ml的莫米松糠酸鹽糖皮質(zhì)激素中含有不超過千萬分之一(0.1 ppm)的該雜質(zhì)。此外，三重四極桿質(zhì)譜在殘留溶劑檢測(cè)方面也有廣泛應(yīng)用，徐宜宏等[37]利用氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式同時(shí)測(cè)定五味子中117種農(nóng)藥殘留量，最低定量限達(dá)到0.005～0.2 mg/kg。

4 小結(jié)與展望

在新藥研發(fā)過程中，雜質(zhì)研究是藥物質(zhì)量控制研究的重要內(nèi)容之一，是保證藥品安全性和可控性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，是藥物一致性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。嚴(yán)格控制雜質(zhì)殘留的要求對(duì)雜質(zhì)的分析方法以及儀器靈敏度提出了更高的要求。當(dāng)今儀器以及技術(shù)的飛速發(fā)展使得實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)成為可能，一大批高精度的儀器投入到痕量雜質(zhì)的研究中，使得對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別也越來越快捷。而且我國在法規(guī)層面上的要求也越來越高，對(duì)我國藥物研發(fā)中的雜質(zhì)控制起到了一定的控制作用。

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