齊育平， 周月婷， 馬澤萍， 陳丹鳳， 蔣冬花

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

羧肽酶(carboxypeptidases，CPs)是一類肽鏈外切酶，能專一性地從肽鏈的C端逐個降解、釋放游離氨基酸，在人類、動物、植物的不同組織器官中發(fā)揮著重要的生理功能[1].絲氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidase，SCP)又稱酸性羧肽酶，是一個龐大的水解酶家族，亞基相對分子質(zhì)量為40 000～75 000，廣泛存在于真菌[2-3]、高等植物[4]和動物組織[5]中，在酸性環(huán)境下具有末端蛋白水解酶、酯酶和脫酰胺酶的活性，可同時參與多肽和蛋白質(zhì)的加工、修飾與降解[6].

絲氨酸羧肽酶在植物生長發(fā)育過程中參與多肽和蛋白質(zhì)的加工、修飾與降解等多個重要環(huán)節(jié)，并且在許多生化途徑,包括次生代謝產(chǎn)物的生物合成、催化酰基轉(zhuǎn)移、除草劑共軛和種子萌發(fā)等相關(guān)蛋白質(zhì)降解中起重要作用[7].動物來源的羧肽酶主要存在于豬、牛等的胰臟中，如羧肽酶A/B(carboxypeptidase A/B)，其數(shù)量非常有限,價格昂貴,導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制；微生物來源的羧肽酶存在于酵母、曲霉等真菌的液泡中，具有廣闊的應(yīng)用前景.因此，借助基因工程策略、采用微生物為宿主大量生產(chǎn)重組羧肽酶，有望克服羧肽酶生產(chǎn)過程中遇到的動植物原料來源有限等限制，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品質(zhì)量、深化酶學(xué)性質(zhì)研究、擴(kuò)展應(yīng)用范圍.

本文采用CODEHOP(Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)[8]在線軟件程序化設(shè)計簡并引物[9-12]，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(RT-PCR)的方法克隆了紅曲菌的絲氨酸羧肽酶基因片段，為后續(xù)的研究打下基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 主要數(shù)據(jù)庫與軟件

NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/);Blockemaker(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html);CODEHOP(http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html);primer premier 6.0.

1.2 菌株與質(zhì)粒

紅色紅曲霉(Monascusruber)由本微生物實(shí)驗室保存.大腸桿菌為DH5α，質(zhì)粒為Takara pMD18-T Vector.

1.3 酶和試劑盒

RNA提取試劑盒為Omega的E.Z.N.A.TMFungal RNA Kit試劑盒，回收試劑盒為Omega的D2500-01Gel Extraction Kit;反轉(zhuǎn)錄酶用Promega的M-MLV Reverse Transcriptase;Taq酶、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、連接酶及引物等均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品.

1.4 簡并引物設(shè)計和篩選

1)查找氨基酸序列.從數(shù)據(jù)庫NCBI中搜索絲氨酸羧肽酶基因的氨基酸序列，選取了曲霉屬(Aspergillus)中具有代表性的如下6個種的序列：紅曲霉Aspergillusniger(GeneBank登錄號：CAA56075)、煙曲霉Aspergillusfumigatus(GeneBank登錄號：XP_752099)、米曲霉Aspergillusoryzae(GeneBank登錄號：EIT73689)、白曲霉Aspergilluskawachii(GeneBank登錄號：GAA91222)、海棗曲霉Aspergillusphoenicis(GeneBank登錄號：BAA04974)和宇佐美曲霉Aspergillususamii(GeneBank登錄號：AFO66605).

2)Block比對.參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行Block比對.登錄Blockmaker，對上述6個序列進(jìn)行Block比對，得到3個高度保守的連續(xù)氨基酸區(qū)域.

3)CODEHOP引物搜索.Block比對后,從Block results界面登錄CODEHOP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行引物搜索.搜索主要參數(shù)設(shè)定為：簡并度64，退火溫度為60 ℃，遺傳密碼為standard，密碼子選用框的備選項沒有目標(biāo)物種，則選用與目標(biāo)物種親緣關(guān)系較近的物種構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans).

4)選取合適的上下游引物.原則：①上下游引物之間的退火溫度相差不超過2 ℃；②簡并度控制在64以下；③上下游引物的位置不能相差太遠(yuǎn)，產(chǎn)物長度控制在1 000 bp以下.

5)利用primer premier 6.0進(jìn)行引物分析.引物不能含有牢固的自身互補(bǔ)序列；避免上下游引物之間互補(bǔ)形成引物二聚體；避免4個以上的連續(xù)單一堿基和同源堿基.

1.5 總RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增

將本實(shí)驗室保存的紅色紅曲霉活化后接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)平板上，28 ℃培養(yǎng)15 d，收集菌絲，參照Omega試劑盒提供的方法提取紅色紅曲霉的總RNA，分別以5-oligo和3-CDS為上下游引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再以設(shè)計好的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增.PCR程序采用降落PCR(Touchdown PCR)：退火溫度從65 ℃降到55 ℃，每循環(huán)下降0.5 ℃，一共20個循環(huán)；再進(jìn)行常規(guī)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；循環(huán)次數(shù)為35，最后72 ℃延伸10 min.

1.6 RT-PCR產(chǎn)物檢測、克隆與測序

制1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，使用Omega D2500-01Gel Extraction Kit試劑盒回收目標(biāo)片段，將回收的片段與pMD18-T Vector連接，熱激法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，克隆過程參照Takara pMD18-T Vector試劑盒說明書.經(jīng)篩選獲得的陽性克隆產(chǎn)物送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序.

1.7 PCR產(chǎn)物分析

應(yīng)用MEGA軟件進(jìn)行序列分析和進(jìn)化樹的建立；核酸和蛋白質(zhì)序列同源性分析應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTN和BLASTX完成.

2 結(jié)果與分析

2.1 簡并引物篩選及cDNA引物

經(jīng)CODEHOP檢索及適當(dāng)篩選，最終選取一對簡并引物用于本實(shí)驗.上游簡并引物(Forward)、下游簡并引物(Reverse)及合成cDNA的引物5-oligo和3-CDS的序列見表1.

表1 引物序列

2.2 紅色紅曲霉培養(yǎng)及總RNA檢測結(jié)果

紅色紅曲霉活化后接到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)15 d得菌落見圖1(a),收集菌絲體用于總RNA的提取.提取的紅色紅曲霉總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果見圖1(b):總RNA 的18S rRNA，28S rRNA和5S rRNA這3條帶非常清晰;28S rRNA和18S rRNA這2條帶非常亮，且28S rRNA的亮度大約為18S rRNA的2倍，5S rRNA條帶相對較暗,說明提取的RNA質(zhì)量較高.

圖1 紅色紅曲霉PDA平板培養(yǎng)15 d的菌落及總RNA凝膠電泳檢測結(jié)果

2.3 RT-PCR結(jié)果

M：DL2000 Mark;1:RT-PCR產(chǎn)物圖2 簡并引物RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

利用表1中的簡并引物進(jìn)行降落PCR，擴(kuò)增出特異的條帶，片段大小與預(yù)測結(jié)果基本一致.由瓊脂糖電泳檢測結(jié)果(見圖2)可見，引物的特異性較好，基本沒有非特異性條帶.小于100 bp的條帶為引物二聚體.

2.4 測序結(jié)果

將目的條帶割膠回收，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序，最終得到一條348 bp的絲氨酸羧肽酶基因片段，其序列見圖3.

2.5 基因片段序列同源性分析

將如上測序結(jié)果以BLASTN進(jìn)行核酸比對，結(jié)果顯示絲氨酸羧肽酶基因分布較廣，且該基因片段與GenBank數(shù)據(jù)庫中多個菌株的絲氨酸羧肽酶基因序列的同源性較高.同時,挑選不同物種的絲氨酸羧肽酶基因序列，使用MEGA5軟件中的Bootstrap Test of Phylogeny和Neighbor-Joining法構(gòu)建絲氨酸羧肽酶基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖4)，直觀地顯示出它們的親緣關(guān)系.

圖3 紅色紅曲霉絲氨酸羧肽酶(SCP)基因片段序列

再將該序列進(jìn)行BLASTX檢索氨基酸序列的相似性，結(jié)果如表2所示.

由表2可知，克隆的紅色紅曲霉DNA所編碼的氨基酸序列與絲氨酸羧肽酶有高度的相似性，其中：與黃曲霉(Aspergillusflavus)的絲氨酸羧肽酶序列比對后總得分為157，同源性達(dá)到73%；與白曲霉(Aspergilluskawachii)和黑曲霉(Aspergillusniger)的絲氨酸羧肽酶序列同源性也分別達(dá)到了58%和59%.說明所克隆的DNA 為絲氨酸羧肽酶序列.

本實(shí)驗用CODEHOP設(shè)計的簡并引物，再結(jié)合降落PCR和高引物濃度,能較好地擴(kuò)增目的片段，減少非特異片段的擴(kuò)增.

圖4 紅色紅曲霉絲氨酸羧肽酶(SCP)基因部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 用BLASTX檢索GeneBank的同源性結(jié)果

3 結(jié)論與討論

利用遺傳密碼的簡并性設(shè)計簡并引物是克隆蛋白質(zhì)家族cDNA和基因組DNA的常規(guī)方法.但由于簡并性問題，所設(shè)計的引物通常簡并性過高，導(dǎo)致有效引物利用率過低，PCR產(chǎn)物特異性不高.雖然可以通過減少簡并引物長度相對降低簡并性，但是由于引物的解鏈溫度(Tm值)過低，PCR假陽性率也會相對提高，有時不得不設(shè)計第3條引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行二次巢式PCR擴(kuò)增[14-17].

與通常設(shè)計的簡并引物不同，CODEHOP所設(shè)計的引物由2部分構(gòu)成：5′端非簡并的“夾板”區(qū)(clamp)和3′端的簡并“核心”區(qū)(core).前者主要考慮到引物的退火溫度，通常其長度為20～30個堿基;后者則是利用約4個高度保守的氨基酸來設(shè)計簡并引物.在PCR體系中，這一引物的雜合結(jié)構(gòu)(5′端的共同區(qū)與3′端的簡并區(qū))在擴(kuò)增早期對源DNA有較好的特異性，而在擴(kuò)增后期對于PCR合成產(chǎn)物有著較高的選擇性.與標(biāo)準(zhǔn)簡并PCR相比，在擴(kuò)增早期，二者與模板DNA的結(jié)合效率都是一致的;在擴(kuò)增后期，標(biāo)準(zhǔn)簡并PCR中與PCR產(chǎn)物結(jié)合的是大多數(shù)引物，而在CODEHOP簡并PCR中，其所有的引物都能與早期PCR產(chǎn)物相結(jié)合，從而大大提高了擴(kuò)增效率.總體來看，CODEHOP程序最大程度地預(yù)測了保守性氨基酸的編碼序列，既減少了引物的簡并度，又保證了PCR產(chǎn)物的特異性[17]，對于克隆未知基因家族片段不失為一種高效簡便的方法.

本實(shí)驗利用工具軟件Block Maker及CODEHOP等程序化設(shè)計軟件設(shè)計出絲氨酸羧肽酶基因部分序列的簡并引物，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模版，采用降落PCR技術(shù),成功地克隆出紅色紅曲霉中絲氨酸羧肽酶基因的部分序列.該DNA片段的成功克隆證實(shí)了絲氨酸羧肽酶在相近種屬間的同源性，也為進(jìn)一步研究紅曲霉中的羧肽酶提供了參考.

參考文獻(xiàn)：

[1]閔柔,黃芳,曾妍,等.宇佐美曲霉羧肽酶成熟肽基因的表達(dá)及鑒定[J].中國生物制品學(xué)雜志,2013,26(2):176-180.

[2]Luis A V,Craig P H,Joel H R,et al.Protein sorting in yeast:The localization determinant of yeast vacuolar carboxypeptidase Y resides in the propeptide[J].Cell,1987,48(5):887-897.

[3]Dal Degan F,Ribadeau-Dumas B,Breddam K.Purification and characterization of two serine carboxypeptidases from Aspergillus niger and their use in C-terminal sequencing of proteins and peptide synthesis[J].Appl Environ Microbiol,1992,58(7):2144-2152.

[4]Potokina E,Prasad M,Malysheva L,et al.Expression genetics and haplotype analysis revealcisregulation of serine carboxypeptidase 1(Cxp1),a candidate gene for malting quality in barley (HordeumvulgareL.)[J].Functional & Integrative Genomics,2006,6(1):25-35.

[5]Remington S J,Breddam K.Carboxypeptidases C and D[J].Methods in Enzymology,1994,244:231-248.

[6]馮英,劉慶坡,賈佳,等.擬南芥絲氨酸羧肽酶類蛋白家族的基因組學(xué)分析[J].遺傳學(xué)報,2005,32(8):864-873.

[7]王育華,鄒杰,陳信波.植物絲氨酸羧肽酶及其類蛋白的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志,2010,27(6):72-75;102.

[8]Louren?o P M L,Almeida T,Mendon?a D,et al.Searching for nitrile hydratase using the Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers strategy[J].Journal of Basic Microbiology,2004,44(3):203-214.

[9]Regeard C,Maillard J,Holliger C.Development of degenerate and specific PCR primers for the detection and isolation of known and putative chloroethene reductive dehalogenase genes[J].Journal of Microbiological Methods,2004,56(1):107-118.

[10]Henikoff S,Henikoff J G,Alford W J,et al.Automated construction and graphical presentation of protein blocks from unaligned sequences[J].Gene,1995,163(2):GC17-GC26.

[11]Henikoff S,Henikoff J G,Pietrokovski S.Blocks+:a non-redundant database of protein alignment blocks derived from multiple compilations[J].Bioinformatics,1999,15(6):471-479.

[12]Rose T M,Schultz E R,Henikoff J G,et al.Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly related sequences[J].Nucleic Acids Research,1998,26(7):1628-1635.

[13]夏瑞,陸旺金,李建國,等.簡并引物的程序化設(shè)計與荔枝HMGR基因片段的克隆[J].果樹學(xué)報,2006,23(6):903-906.

[14]王洪振,周曉馥,宋朝霞,等.簡并PCR技術(shù)及其在基因克隆中的應(yīng)用[J].遺傳,2003,25(2):201-204.

[15]曾會明,王天祥,王華芳,等.白臘DREB基因克隆中簡并引物的設(shè)計[J].生物技術(shù)通訊,2004,15(4):342-345.

[16]史兆興,王恒樑,蘇國富,等.簡并PCR及其應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊,2004,15(2):201-204.

[17]黃菁,王少麗,喬傳令.程序化設(shè)計簡并引物與克隆小菜蛾酯酶基因[J].昆蟲知識,2002,39(6):458-461.